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建立α与β珠蛋白基因簇转基因鼠模型及β基因族反式因子研究
随着人类功能基因组研究的广泛开展,理解基因组中的遗传信息如何协调、有序地调控细胞分化与个体发育的时空过程成为研究的基本问题,阐明这一机制是真核基因表达调控研究的根本任务.
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小鼠去信号肽AFP/DC疫苗体外抗肝癌免疫活性的检测
目的构建Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,观察其抗肝癌的免疫活性.方法构建AFP1cDNA和AFP2cDNA,真核表达载体,体外转染DC,制备AFP1-DC和AFP2-DC疫苗,以ELISA、MTT方法等检测其免疫活性.TUNEL法检测肝癌细胞凋亡情况.结果所构建的真核表达质粒PcDNA3.1(+)/AFP1和PCDNA3.1(+)/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,其中PcDNA3.1(+)/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)明显高于空质粒组,AFP2/DC疫苗诱导出肿瘤特异性杀伤肝癌细胞活性明显高于空质粒组.结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1(+)/AFP1和PcDNA3.1(+)/AFP2,AFP2/DCS能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应,其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关.
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人突变CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
①目的构建人突变CD59的真核表达系统,并筛选高表达细胞.②方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞;G418筛选出阳性克隆,流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Western-blot筛选高表达CD59细胞.③结果成功构建人突变CD59的真核细胞表达系统;运用各种免疫学技术检测获得CD59高表达细胞.④结论人突变CD59在CHO细胞中高表达,为进一步研究CD59分子的功能奠定基础.
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小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测
背景与目的:探索肝癌细胞的突变基因产物--具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理,寻找肝癌的特异性抗原,并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响.本实验构建BALB/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突细胞(dendritic cells,DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用.方法:采用RT-PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA,将该基因定向插入真核表达载体PEGF-N3中;同时培养经rmGM-CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞,体外获取大量DCs,脂质体转染PEGF-N3/AFPi、PEGF-N3/AFP2至DCs进行表达、鉴定.将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)分泌活性,51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性.结果:从H22中克隆到AFP1cDNA和AFP2 cDNA,经测序完全正确,所构建的真核表达质粒PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达,其中PEGF-N3/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)为5.12±1.46,明显高于空质粒组(1.42±0.73).AFP2/DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[(88.15±16.47)%]明显高于空质粒组[(12.72±5.45)%].结论:成功地构建了真核表达载体PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的PEGF-N3/AFP2转染的DC,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应.其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡.
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突变人CD59基因在真核细胞中的表达活性
目的构建突变人CD59的真核表达系统,检测突变人CD59蛋白糖化前后抗补体活性,探讨CD59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用,为人类糖尿病血管增殖症的发病机理提供依据.方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染人CHO细胞;G418筛选出阳性克隆,流式细胞术进一步筛选出高表达克隆;免疫组化、免疫荧光、Western-blot、ELISA验证CD59的表达;BCECF释放试验研究糖化前后突变人CD59抗补体活性.结果成功构建突变人CD59的真核细胞表达系统;糖化后较糖化前突变人CD59转染CHO细胞BCECF释放率明显升高.结论高糖使CD59活性下降,可能导致或加速糖尿病血管并发症的发生.
