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新杂合双突变致遗传性抗凝血酶缺陷症的分子机制
目的 探讨抗凝血酶(AT)新杂合双突变致遗传性抗凝血酶缺陷症的分子机制.方法 将野生型质粒(AT wt)及突变型质粒(AT-c.134G＞A、AT-c.342T＞G、AT-c.134G＞A和c.342T＞G)瞬时转染HEK293T细胞进行体外表达.Western印迹检测质粒转染细胞裂解液中AT抗原；同源模建构建AT三维空间结构,细胞免疫荧光染色检测AT蛋白在细胞内的分沁情况.结果 Western印迹:AT-c.342T＞G和AT-c.134G＞A和c.342T＞G质粒转染细胞裂解液AT蛋白表达趋势明显增加.同源模建显示第82位碱基突变为Arg后致碱基侧链明显延长,与周围碱基距离缩短.第13位碱基突变为Gln后致局部空间结构改变,与肝素间距离延长.激光共聚焦显示:AT突变体质粒表达蛋白在内质网中聚集增加.结论 新杂合双突变(AT-c.134G＞A和c.342T＞G)致遗传性抗凝血酶缺陷症的分子机制为突变体AT在细胞内潴留,并且AT-c.342T＞G突变起主导作用.
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I型遗传性抗凝血酶缺陷症两种新基因突变
目的 对两例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断,并探讨其分子发病机制.方法 检测凝血与抗凝指标,并进行易栓症筛查和表型诊断.采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员AT抗原(AT:Ag)和AT活性(AT:A),抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因(GI号28906)7个外显子及其侧翼序列、5'及3'端非翻译区,利用直接测序法进行基因序列分析.针对先证者的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在正常人群中筛查以排除多态性.结果 先证者1和先证者2 AT:Ag分别为126 mg/L和117 mg/L,AT:A分别为49%和48%.先证者1和先证者2的AT基因2号外显子分别发现了杂合缺失突变3239～3240delCT和杂合无义突变3206A→T(K70Stop),其家系部分成员检测到相应的杂合突变.结论 两例先证者均为I型遗传性AT缺陷症,由AT基因3239-32ZlOdelCT和3206A→T(K70Stop)突变所致.
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一种新的抗凝血酶基因突变导致遗传性抗凝血酶缺陷症
目的 对1例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症患者及其家系成员AT活性(AT:A)、AT抗原含量(AT:Ag)进行检测及基因分析,探讨该遗传性AT缺陷症发病的分子机制.方法 采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT:A和AT:Ag,提取外周血基因组DNA,PCR法扩增AT基因的全部7个外显子及侧翼序列,DNA序列分析AT的基因异常.结果 先证者AT:A和AT:Ag分别为45%和97 mg/L,为Ⅰ型AT缺陷症.AT基因外显子5区第9833位核苷酸发生杂合性T-A突变,引起Tyr363Stop(Y363X)无义突变.其他家系成员基因测序结果显示有4人(Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅲ7、Ⅲ14)存在该突变.结论 该家系为Ⅰ型遗传性AT缺陷症.AT基因外显子5区杂合性9833 T→A无义突变引起AT缺陷,导致静脉血栓是该遗传性AT缺陷症的分子致病机制.该突变在国际上尚未见报道.
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同一等位基因复合杂合突变导致I型遗传性抗凝血酶缺陷症
目的对1例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断.方法 采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原(AT:Ag)和AT活性(AT:A),抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因(SERPINC1)7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析.针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性.结果 先证者AT:Ag和AT:A分别为114 mg/L和54.8%.其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G>A和c.342T>G.其家系部分成员检测到相应的杂合突变.家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因.结论 同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因.
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两个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型与基因突变分析
目的 对两个遗传性抗凝血酶(antithrombin,AT)缺陷症家系进行表型诊断和基因分析,探讨其分子发病机制.方法 检测2例先证者及其家系成员凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、纤维蛋白原、抗凝血酶活性(antithrombin activity,AT:A)、抗凝血酶抗原(antithrombin antigen,AT∶Ag)、蛋白C活性及蛋白S活性等指标以明确诊断.提取外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因全部外显子、侧翼及5 '、3 '非编码区,PCR产物经纯化后直接测序,寻找基因异常位点,并通过反向测序及银染色进行验证.借助生物信息学软件辅助分析突变对蛋白的影响.结果 先证者1的AT.Ag正常但AT:A降低至30％,其大儿子、小儿子、小女儿AT∶A在正常值的50％左右;AT基因第2外显子和第5外显子分别存在杂合错义突变c.235C＞T(p.Arg47Cys)和两个多态性位点(c.981G＞A、c.1011G＞A),同样突变也见于其大儿子、小儿子和小女儿.先证者2的AT∶A、AT:Ag分别为39％和103 mg/L,其父亲为57％和114mg/L,均明显低于正常对照;AT基因第3外显子发生杂合缺失突变g.5890-5892delctt,导致p.Phe121丢失,其父亲亦携带该突变位点.SIFT和PolyPhen-2程序对c.235C＞T分析表明,错义突变Arg47Cys会对AT蛋白功能产生影响;spdbv软件和PIC程序对g.5890-5892delCTT分析显示,缺失突变导致Phe121与Ala124、Lys125的氢键连接以及与Lys125、Arg47的阳离子-π作用力消失,从而影响蛋白稳定性.结论 先证者1表现为Ⅱ型AT缺陷,先证者2表现为Ⅰ型AT缺陷;两例先证者抗凝血酶水平可能与错义突变p.Arg47Cys及缺失突变g.5890-5892delCTT有关.
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3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型和基因型关系的研究
目的 探讨遗传性抗凝血酶缺陷症家系表型和和基因型的关系.方法 对3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系(家系1～3)作表型和基因型诊断:常规检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血酶时间(TT)以筛查凝血功能,发色底物法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性(PC∶A,PS∶A及AT∶A),免疫比浊法检测抗凝血酶抗原(AT∶Ag),Western blot检测血浆中抗凝血酶的分子量和含量;PCR扩增AT基因所有外显子及侧翼序列,DNA测序并进行基因分析.针对新基因突变,在100例正常人中检测相应突变以排除多态性,用TA克隆PCR产物测序鉴定杂合碱基缺失突变.结果 3名先证者均为反复发作的静脉血栓患者,凝血指标及PC:A和PS∶A都正常,AT∶A分别为正常人(100%)的60%、52%和60%,AT:Ag分别为16.9、14.1和11.4 mg/dl,Western blot显示3位先证者的血浆AT蛋白分子量正常(58 kD)而含量低于正常;基因分析发现3名先证者各携带1个杂合突变,分别为g.8263 C＞T(Leu340Phe)、g.5894-6 delTTC(Phe122del)和g.5898 T＞G(Phe123Cys).3个家系中与先证者表型相似的成员,则携带有相同的AT基因突变;但除家系2先证者的父亲有静脉血栓外,家系1和3中含有相应AT基因突变的家庭成员均无血栓发生.结论 3名先证者遗传性抗凝血酶缺陷症分别由Leu340Phe、Phe122del和Phe123Cys突变所致,其中Leu340Phe和Phe123Cys突变为国际上首次报道.
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遗传性抗凝血酶缺陷症凝血指标筛查在疾病早期快速诊断的分析研究
目的：探讨检测血浆抗凝血酶(AT)活性(A)、血浆抗凝血酶(AT)抗原(Ag)、蛋白S(PS)、血浆蛋白C(PC)以及D-二聚体等凝血易栓指标对诊断遗传性抗凝血酶缺陷症的临床价值。方法：选择42例抗凝血酶缺陷症患者作为疾病组，再根据PS、PC水平将疾病组进一步分为单纯AT缺乏组、AT联合PS缺乏组、AT联合PC缺乏组和AT、PS、PC全缺乏组；同时选择60名健康查体人员作为健康对照组。用发色底物法检测两组AT∶A、PC及PS活性；用免疫比浊法检测两组AT∶Ag及血浆D-二聚体浓度水平。采用独立样本的t检验比较各组间差异。结果：AT缺陷症组AT∶A和AT∶Ag水平明显减低，与健康对照组比较差异有统计学意义(t=-11.68， t=-6.118；P＜0.01)；AT联合PS、PC缺乏患者的PS、PC水平明显减低，与健康对照组比较差异有统计学意义(t=-9.397, t=-3.065；P＜0.01)；AT缺陷症组患者血浆D-二聚体水平明显增高，与健康对照组比较差异有统计学意义(t=4.358，P＜0.01)。结论：AT缺陷是静脉血栓栓塞性疾病的主要遗传性危险因素，检测其相关凝血指标有助于疾病的早期诊断，为临床提供诊疗依据，对预防静脉血栓栓塞症(VTE)的发生起到预警作用。
