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Cr(Ⅵ)对果蝇S2细胞凋亡影响及机制的初步研究
目的 研究Cr(Ⅵ)对果蝇S2细胞凋亡的影响,初步探讨其可能的凋亡机制.方法 将果蝇S2细胞分别暴露于含Cr(Ⅵ)终浓度为0(对照)、50、100、200、400、800μmol/L的新鲜培养基培养12h.检测果蝇S2细胞的凋亡情况和凋亡相关基因Debcl、Buffy、Drice、P53 mRNA的表达水平及Drice的相对活化程度.结果 Cr(Ⅵ)处理浓度为400 μmol/L时可观察到S2细胞染色质浓染、出现凋亡小体,当Cr(Ⅵ)浓度达到800 μmol/L时,可明显观察到细胞崩解及坏死;与对照组比较,各剂量Cr(Ⅵ)染毒组果蝇S2细胞的早期凋亡率均较高,差异有统计学意义(P＜0.05).当Cr(Ⅵ)浓度为50～400 μmo/L时,果蝇S2细胞的早期凋亡率随着Cr(Ⅵ)浓度的上升而升高;当Cr(Ⅵ)浓度达到800 μmol/L时,果蝇S2细胞的早期凋亡率下降.与对照组比较,400μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组果蝇S2细胞Debcl、Drice mRNA的表达水平均较低,P53 mRNA的表达水平均较高,差异有统计学意义(P＜0.05);而Buffy mRNA的表达水平无明显改变,Drice相对活化程度降低(P＜0.01).结论 天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)并未参与高浓度下Cr(Ⅵ)诱导果蝇S2细胞的凋亡过程,其凋亡机制可能与P53基因相关.
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果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定
目的:构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒.方法:用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3 -Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性.结果:构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3 -Control中增加了2.7万倍.结论:成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3 -pac.
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SARS-CoV Spike蛋白受体结合区的表达及纯化
目的 获得稳定表达SARS冠状病毒spike蛋白受体结合区的果蝇细胞系,表达spike蛋白受体结合区.方法 设计引物扩增spike蛋白受体结合区318-513片段,构建重组表达载体S318-pMT/Bip/V5-his,与pCoBlast质粒共转染果蝇S2细胞,经Blasticidin筛选得到的稳定重组细胞系,用硫酸铜诱导表达,Western-Blot检测表达产物.富集的表达产物用镍柱和RESOURCES阳离子交换树脂纯化,SDS-PAGE和Western-Blot检测纯化产物.结果 重组spike蛋白受体结合区可在果蝇S2细胞中分泌表达,且具有特异免疫反应性;经镍柱和RESOURCES纯化可得到纯度达90%以上的重组蛋白.结论 克隆并在真核生物中分泌表达出具免疫反应原性的spike蛋白受体结合区,镍柱和RESOURCES两步纯化可得到高纯度蛋白.
关键词： SARS-CoV ACE2结合区 果蝇S2细胞 表达 纯化 -
Cr(Ⅵ)对果蝇S2细胞增殖及氧化应激的影响
目的 研究Cr (Ⅵ)对果蝇S2细胞增殖及氧化应激相关指标的影响,初步探讨二者的关系,为利用果蝇S2细胞研究Cr (Ⅵ)的毒性作用提供一定的理论依据.方法 利用含不同浓度Cr (Ⅵ) (50、100、200、400、800μmol/L)的培养基培养果蝇S2细胞;CCK-8法检测培养基中不同浓度Cr (Ⅵ)对果蝇S2细胞增殖的影响;分光光度法检测培养基上清中SOD、MDA含量.结果 随着Cr (Ⅵ)浓度升高,S2细胞的生存率逐渐降低并存在显著的剂量依赖关系,当800 μmol/L时Cr (Ⅵ)对S2细胞的抑制率已高达(88.51±0.72)％;SOD活力自200 μmol/L处理浓度开始即与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),随Cr (Ⅵ)处理浓度增加SOD含量逐渐降低;各处理组脂质氧化终产物MDA含量与对照相比差异均有统计学意义(P＜0.05),随Cr (Ⅵ)处理浓度增加MDA含量逐渐升高.结论 Cr (Ⅵ)可显著抑制S2细胞增殖,且呈高度剂量依赖性;Cr (Ⅵ)可导致S2细胞氧化应激,氧化应激可能是Cr(Ⅵ)抑制S2细胞增殖的重要原因之一.
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HCV结构蛋白E2在果蝇S2细胞中的稳定表达
目的 获得在果蝇S2(S2)细胞中稳定表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(rE2).方法 PCR 扩增截短型E2基因,克隆至pCR2.1-T载体,将测序正确的基因亚克隆至表达载体pMT/Bip/VS-HisC,构建重组表达载体pMT-E2.用FuGENE HD转染试剂将pMT-E2转染至S2细胞,并筛选抗性细胞,然后诱导目的蛋白表达；以Western-blotting法鉴定表达产物与HCV感染者血清反应性.结果 成功构建截短型HCV E2表达载体pMT-E2,并获得到稳定表达rE2蛋白的S2细胞株,Western-blotting法证明rE2具有良好的免疫学活性.结论 在S2细胞成功表达的HCV rE2蛋白可用于HCV感染者血清的鉴定,为HCV诊断性抗原的优化和重组疫苗的研发提供了实验材料.
