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Rluc报告基因在大肠杆菌中的表达及检测条件优化
目的 研究海肾荧光素酶报告基因(Rluc)在大肠杆菌中的表达情况及优化检测条件.方法 将Rluc克隆入大肠杆菌JM109,提取质粒后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切,并与制备好的pET-30a(+)载体连接,再转化入大肠杆菌BL21.然后用ViviRen底物检测不同稀释液、不同浓度及时间等情况下重组克隆子中Rluc报告基因的荧光表达量,绘制表达曲线.结果 成功构建了Rluc在B121中的表达克隆子;ViviRen底物用PBS稀释比用LB稀释的检测灵敏度高约2倍;荧光检测的表达曲线在底物加入后迅速上升,至10min时达高峰,然后缓慢下降;阳性克隆子中Rluc的荧光表达线性检测范围广,阴性对照菌株中背景低;总结出了ViviRen底物用PBS稀释、荧光信号在10min后进行瞬时测定等优化检测条件.结论 Rluc报告基因可在大肠杆菌内高效表达,检测方法 具有特异性好、灵敏度高等特点.
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人RNF6基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的表达
目的 构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 提取前列腺癌细胞CWR22Rvl的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX5X-1,在E.coli BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 hRNF6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在E.coli BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量为104KD,免疫印迹检测到了融合蛋白表达.结论 成功构建hRNF6基因原核表达载体,诱导表达出GSTRNF6融合蛋白.
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人RACK1蛋白在HEK-293 T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位
目的构建可以表达有活性的蛋白激酶 C 受体(RACK1)的重组质粒，检测其在细胞内的表达与定位情况。方法设计上下游引物，以RACK1全长cDNA序列为模板， PCR扩增出 RACK1序列，分别构建到载体 pcDNA3.1和pGEX-5X-3。转染pcDNA3.1-FLAG-RACK1到人胚胎肾细胞(HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞)，转化pGEX-5X-3-RACK1到大肠杆菌 BL21感受态细胞中表达， Western blot法和考马斯亮蓝染色法检测RACK1表达情况，免疫荧光法研究其细胞内定位。结果成功构建了 pcD-NA3.1-FLAG-RACK1和GEX-5X-3-RACK1重组质粒。 West-ern blot证明了其在HEK-293T细胞中的表达，考马斯亮蓝染色显示其在BL21菌株也能大量表达，免疫荧光显示RACK1在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论人RACK1在HEK-293T细胞和BL21菌株中均能有效表达，在COS7细胞的胞质、胞核均有分布，为进一步研究人RACK1基因的功能奠定了基础。
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人通用转录因子GTFIIF2表达与定位
目的构建不同标签的人通用转录因子 IIF多肽2(GTFIIF2)表达载体，观察其细胞内的表达和定位。方法设计GTFIIF2的引物，以全长cDNA序列为模板，利用聚合酶链式反应技术扩增 GTFIIF2全长序列，构建 pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和 pCDGFP-GTFIIF2质粒，利用 Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞表达与定位；构建GST-GTFI-IF2质粒，转化到BL21菌株，用IPTG诱导剂诱导融合蛋白表达，用SDS-PAGE分析诱导表达情况。结果免疫荧光法检测GTFIIF2蛋白集中分布在COS7细胞核中，在细胞质没有分布；pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒能够在HEK293T细胞中有效表达；GST-GTFIIF2在BL21菌株中很好的诱导表达。结论 GTFIIF2在 COS7细胞、HEK293T细胞和BL21感受态细胞中能有效表达，为更好地了解GTFIIF2蛋白在细胞内的功能提供一定的研究基础。
