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Ahi-1基因导入Jurkat细胞中表达及功能的研究
本研究目的是探讨Ahi-1基因及其编码蛋白在人T淋巴细胞白血痛Jurkat细胞中的表达、细胞内定位以及Ahi-1基因对Jurkat细胞生长的调控作用.分别应用Northern blot、Wemtem blot检测Ahi-1基因的mRNA及蛋白表达水平.构建Ahi-1的真核表达质粒并导入Jurkat细胞,用G418筛选获得稳定过表达Ahi-1基因的Jurkat-A细胞,用XTT法检测细胞的增殖活性,半固体培养法检测细胞集落形成能力.结果表明:正常人外周血淋巴细胞(PBL)、Jurkat细胞以及HUT78细胞均表达6.5、4.2以及2 kb的Ahi-1基因mRNA转录本.PBL及Jurkat细胞均表达140 kD的Ahi-1蛋白且主要定位于细胞浆内,但在细胞核内未见表达.PBL尚表达120 kD的Ahi-1蛋白,主要存在于细胞核内,Jurkat细胞中120 kD的Ahi-1蛋白表达水平低下.甲异靛、阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉酯碱(HHT)、甲氨喋呤(MTX)以及鬼臼乙叉甙(VPl6)可诱导Jurkat细胞核内140 kD的Ahi-1蛋白表达增强,甲异靛降低细胞浆内Ahi-1蛋白表达.与转染质粒对照Jurkat细胞(Jurkat-C)相比,高表达外源性Ahi-1的Jurkat-A细胞的生长及集落形成能力显著低于Jurkat-C细胞;细胞总c-myb蛋白表达水平无改变,但Jurkat-A细胞中磷酸化c-myb蛋白表达增强;细胞中AKT磷酸化水平无明显变化.结论:Jurkat细胞表达6.5、4.2以及2 kb的Ahi-1转录本;140kD的Ahi-1蛋白主要定位于细胞浆中,多种化疗药物可诱导细胞核内140 kD的Ahi-1蛋白表达增强;过表达外源性全长Ahi-1可抑制Jurkat细胞的生长及集落形成能力,并诱导c-myb蛋白磷酸化.
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胰岛素样生长因子及其受体在难愈性溃疡组织中的表达特征
目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)与其受体两亚基(IGF-Ⅰ Rα和IGF-Ⅰβ)在正常皮肤和溃疡组织中的分布和表达特征及其与溃疡形成的关系.方法:16例被测标本中包括不同类型的皮肤溃疡组织8例和正常皮肤8例.用常规病理技术和免疫组化方法确定这三种蛋白在不同组织中的定位和表达量的变化规律.结果:在正常皮肤中,IGF-Ⅰ蛋白主要存在于表皮细胞、内皮细胞和部分成纤维细胞内,而其受体的阳性信号主要分布于表皮细胞的细胞膜上.在溃疡组织中,与正常皮肤相比IGF-Ⅰ表达虽有所升高,但增加不显著(P＞0.05),蛋白定位也无明显差异.含有IGF-ⅠRα和IGF-Ⅰβ蛋白的阳性细胞主要为部分表皮细胞、单核细胞和巨噬细胞,两种蛋白的阳性表达率分别显著降至为正常皮肤的43.9%和50.0%(P＜0.05).结论:在IGF-Ⅰ因子高浓度环境中,溃疡创面难愈性修复可能与IGF-Ⅰ Rα和IGF-Ⅰβ蛋白表达下降,引起因子与受体结合发生障碍相关.
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小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究
目的 构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况.方法 取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上.采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果.结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质.结论 成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具.
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C反应蛋白真核表达载体的构建与表达
目的 构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况.方法 利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Western blot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HACRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析.结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,peDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域.结论 成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具.
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新基因LRP15的功能预测及其编码蛋白定位
目的:确定白血病复发相关新基因LRP15编码蛋白的亚细胞定位,利用生物信息学探索网上预测基因功能的新方法.方法:以人类基因组资源(HGR)数据库为基础,进行LRP15启动子区特征分析.在Prosite数据库中进行有生物学意义的保守性氨基酸修饰位点搜索.通过RPS-BLAST程序预测其蛋白质结构及功能.以增强绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,利用激光共聚焦显微镜等实验方法验证生物信息学的分析结果.结果:LRP15编码蛋白含有 cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,其N端有一个富含亮氨酸重复序列,定位于细胞核内.结论:生物信息学是预测基因功能的有效方法;利用EGFP可以将LRP15蛋白定位于细胞核内;LRP15基因可能是一个参与细胞发育调控的新基因.
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LATS2基因在肿瘤研究中的新进展
1 LATS2的概述1.1 LATS2基因编码的蛋白质及生物学作用 LATS2基因属于拉特抑癌家族,编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.该蛋白定位于中心体,作用于细胞各个时期.参与形成aurora-A和ajuba蛋白,负责积累γ-微管蛋白和纺锤体的形成,在中心体有丝分裂环节中起到重要作用[1].LATS2还作为一个负调控因子参与p53功能调控,并可能在与p53功能的一个正反馈循环中起到重要作用[2].此外,它还参与雄激素应答基因表达的抑制[3].
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比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位
目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.
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PTEN蛋白在喉鳞癌中表达的研究
PTEN抑癌基因是迄今为止发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于人类染色体10q23,全长200 kb.PTEN蛋白定位于细胞质,具有双特异性磷酸酶活性,在酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导的信号传递过程中具有重要作用.PTEN基因异常表达与肿瘤的侵袭、转移和生长有关.本研究采用免疫组织化学技术对喉鳞状细胞癌中PTEN蛋白的表达情况进行研究,旨在探讨PTEN蛋白在喉鳞癌的发生、发展中的临床意义.
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蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的表达及其定位
目的:检测小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期中蛋白激酶Wee1B的表达水平及其定位水平,初步阐明Wee1B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制.方法:超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B的mRNA和蛋白表达水平;放射自显影测定Wee1B活性;间接免疫荧光观察Wee1B在各个细胞时期的定位.结果:小鼠1-细胞期受精卵G1、S、G2和M期Wee1B mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P＞0.05);S、G2和M期Wee1B蛋白表达量与G1期比较差异有统计学意义(P＜0.01);与G1期比较,S、G2期Wee1B活性逐渐增高(P＞0.05,P＜0.01),M期Wee1B活性迅速下降(P＜0.01).G1期和S期细胞Wee1B蛋白偶联的红色荧光信号主要集中分布于细胞核,但在G2期细胞红色荧光信号弥散分布于细胞浆,在M末期和2-细胞期可见红色荧光信号又重新分布于细胞核,细胞浆内荧光减弱.结论:蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期动态表达,Wee1B蛋白存在核浆转位,Wee1B的定位变化可能调控小鼠受精卵有丝分裂.
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用于表位抗原标记的抗HA高亲和性抗体(3F10)
新的抗HA高亲和性抗体(3F10克隆)现在可与生物素、荧光素(FITC)或辣根过氧化物酶(HRP)有效结合,这些结合物与市售的其他抗HA抗体产生相比,结果更清晰.敏感性更高,特异性更好.由于此抗体具高亲和性,所以用低浓度的抗体就可以获得更好的特异性.另外,抗HA高亲和性抗体结合物使蛋白定位和测定工作简单化,可做一些以前无法进行的试验.
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ACRV1在人睾丸组织中的表达特征分析
目的 分析ACRV1基因在人睾丸组织中的表达变化,方法 采用人全基因组Affymetrix表达谱芯片,分析一个27岁正常男人睾丸和6月龄胎儿睾丸的差异表达基因谱,筛选得到ACRV1基因的表达值,然后通过免疫组织化学的方法鉴定ACRV1基因在人睾丸组织中的表达定位.结果 对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后,筛选得到ACRV1基因在芯片上表达值,代表ACRV1基因的探针208013_s_at在6月龄胎儿睾丸和27岁成人睾丸中的表达值分别是5.8(A)和1210.7(P),表明该基因在胎儿期睾丸中没有表达,在成年期睾丸中出现高表达,免疫组织化学实验显示该基因的蛋白质只表达于成人睾丸组织中的长形精子的头部,在睾丸组织的其他位置均无表达.结论 ACRV1基因特异性地表达于成人精子细胞的头部,提示该基因在精子发生中起着重要作用.
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核糖核酸酶T2在人精液中的鉴定和定位
子和精浆中的存在及其与肌动蛋白的定位关系提示其在精子成熟、获能、项体反应等过程中可能发挥着重要作用.
关键词： 核糖核酸酶T2(RNaseT2) 肌动蛋白(actin) 人精子 精浆 蛋白定位 -
绿色荧光蛋白在白念珠菌研究中的应用
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一种来源于水母的生物发光蛋白.GFP基因作为报告基因已被广泛应用于各种生物的研究中.白念珠菌感染在临床真菌感染中占有很大的比例,因此对白念珠菌进行深入研究具有重要意义.GFP在白念珠菌的研究中已得到广泛的应用.GFP基因可与目的 基因融合形成融合基因,融合基因可表达融合蛋白,该融合蛋白可发出荧光信号,进行基因表达和蛋白定位等方面的研究.本文综述了GFP在白念珠菌研究中的应用.
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犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的定位研究
目的 用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记犬小孢子菌PQ-LRP蛋白,明确PQ-LRP蛋白在犬小孢子菌中的定位.方法 提取犬小孢子菌总RNA,反转录为cDNA作为模板,PCR扩增PQ-LRP基因,将PQ-LRP基因与EGFP基因构成融合基因,连接到pCAMBIA 1300质粒载体,采用根癌农杆菌转化法对犬小孢子菌进行转化,使融合基因LRP-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的细胞定位.结果 成功构建表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP,融合基因LRP-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达.激光共聚焦显微镜下LRP-EGFP的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞膜上.结论 LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中成功表达,且PQ-LRP蛋白定位于犬小孢子菌细胞膜上.
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人通用转录因子GTFIIF2表达与定位
目的构建不同标签的人通用转录因子 IIF多肽2(GTFIIF2)表达载体，观察其细胞内的表达和定位。方法设计GTFIIF2的引物，以全长cDNA序列为模板，利用聚合酶链式反应技术扩增 GTFIIF2全长序列，构建 pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和 pCDGFP-GTFIIF2质粒，利用 Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞表达与定位；构建GST-GTFI-IF2质粒，转化到BL21菌株，用IPTG诱导剂诱导融合蛋白表达，用SDS-PAGE分析诱导表达情况。结果免疫荧光法检测GTFIIF2蛋白集中分布在COS7细胞核中，在细胞质没有分布；pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒能够在HEK293T细胞中有效表达；GST-GTFIIF2在BL21菌株中很好的诱导表达。结论 GTFIIF2在 COS7细胞、HEK293T细胞和BL21感受态细胞中能有效表达，为更好地了解GTFIIF2蛋白在细胞内的功能提供一定的研究基础。
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有机阳离子转运体1/2在人角、结膜上皮细胞的表达及极性分布
目的 观察有机阳离子转运体1/2 (OCTN1/2)在人角、结膜上皮细胞的表达及极性分布.方法 分别采用RT-PCR和Western blot法检测OCTN1/2的mRNA在人角膜边缘上皮(HCLE)细胞和人结膜上皮(HCjE)细胞的表达及其蛋白的极性分布.结果 在HCLE细胞和HCjE细胞中均检测到了OCTN1和OCTN2的mRNA扩增产物.测序结果证实,PCR扩增产物与目的基因具有同一性.在HCLE细胞中,OCTN1的mRNA相对表达水平明显高于OCTN2,但在HCjE细胞中,OCTN1的mRNA相对表达水平则明显低于OCTN2,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,OCTN1和OCTN2 2种转运蛋白均在细胞顶端出现明显强于基底端的条带.结论 人角膜和结膜上皮细胞均存在OCTN1和OCTN2 2种转运蛋白的表达,且OCTN1和OCTN2主要位于HCLE细胞和HCjE细胞的顶端.
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RAP80在DNA损伤反应中的作用
DNA在遭受电离辐射、类辐射性药物、化学损伤等刺激后会发生DNA双链断裂(Double-strand break,DSB),此时DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)调控激活一系列细胞周期检查点、DNA修复网络并促使凋亡反应发生,以确保精确修复损伤位点,维持基因的完整性.许多研究报道,受体相关蛋白80(receptor-associated protein 80,RAP80)在DNA损伤反应中有着重要作用,可促使一系列修复蛋白定位到正确的DNA损伤位点.现对RAP80在DNA损伤反应中的作用综述如下.
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植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位
目的 构建小鼠植烷酸氧化酶(Phyh)真核表达载体,并观察其在NIH 3T3细胞中的表达定位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH 3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA.Phyh在NIH 3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析.结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中.结论 成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH 3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具.
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两种细胞系中内源性C-反应蛋白的表达和定位分析
目的 观察在不同刺激条件下,不同组织来源细胞系中内源性C-反应蛋白(CRP)的表达及定位情况.方法 培养人单核细胞系THP-1和人肝细胞系LO2,用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;使用内毒素(LPS)对两种细胞进行刺激,同时收集LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清加人到LO2细胞的培养液中进行孵育,运用Westernblot和免疫细胞化学技术检测上述刺激条件下CRP在两种细胞中的表达及其定位情况.结果 Western blot检测表明,在未受到刺激时,两种细胞的裂解物中均检测到一定量的CRP,在细胞培养液上清中没有检测到;受到LPS刺激后,THP-1细胞内的CRP表达增加,且在培养液上清中也检测到少量的CRP,但对于LO2细胞,刺激前后CRP的表达和分泌没有明显变化:当用LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清处理LO2细胞后,在LO2的细胞裂解物和培养液上清中均检测到CRP.免疫细胞化学检测结果显示,整个THP-1细胞中均可检测到标记的CRP的荧光信号,其中以核内的明显.LPS刺激可以增加该蛋白的表达,使其核定位更加明显;在LO2细胞中,CRP定位于核外,LPS刺激对其表达和定位没有明显影响.而给予LPS刺激的THP-1细胞培养液上清处理后,LO2细胞中标记CRP的荧光信号增强,尤其以细胞膜上的增强明显.结论 LPS不能直接上调肝细胞LO2内的CRP表达,却可以诱导THP-1表达分泌某些细胞因子来增加CRP的合成分泌;CRP在肝细胞系LO2和单核.巨噬细胞系THP-1中的定位有明显不同,在LO2中主要表现为分泌型蛋白的定位特征,而在THP-1细胞中却有明显的核定位表现.
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bc1-2基因与头颈部肿瘤
抗凋零基因bc1-2(B Cell Leukaemia/Lymphoma-2)是一种原癌基因,早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18位断裂点t(14:18)(q31:q21)中得到,免疫电镜检测bc1-2基因表达蛋白定位于细胞内氧自由基产生的位置.如线粒体、核周膜和内质网[1].bc1-2是已明确的抗凋亡基因.研究表明bc1-2基因与许多肿瘤发生、发展密切相关,可作为评估肿瘤预后的一个参数,是细胞凋亡的调控因子.高等动物中第一个被确认的存活基因就是bc1-2基因,它能阻遏程序性细胞凋亡(Apoptosis)和延长细胞生命,但不促进细胞增殖[2].关于bc1-2抗凋亡作用及机理与肿瘤发生发展关系的研究是目前该领域内受关注的问题之一.本文将bc1-2基因异常及其与头颈部癌的关系作一综述.
