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线粒体分裂抑制剂对心肺复苏后脑功能及神经元凋亡的影响
目的 探讨线粒体分裂抑制剂1(mdivi-1)在复苏后大鼠脑损伤中的作用及其机制.方法 将50只健康成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组,n=8)、心搏骤停模型组(CA组,n=14)、二甲基亚砜对照组(DMSO组,n=14)和mdivi-1组(n=14).以窒息法诱导大鼠CA后进行心肺复苏(CPR);自主循环恢复(ROSC)后,mdivi-1组静脉注射1.2 mg/kg mdivi-1进行干预,DMSO组注射等体积0.1％DMSO.复苏后24、48和72 h,对各组大鼠进行神经功能缺损评分(NDS);复苏后72 h留取各组大鼠脑组织,苏木素-伊红(HE)染色,观察海马组织病理学改变,并计数正常神经元;采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测海马组织神经元凋亡;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测线粒体和胞质中细胞色素C(Cyt-C)蛋白表达.结果 各实验组复苏后NDS评分逐渐升高;CA组复苏24、48、72 h NDS评分较Sham组明显降低(分:51.5±3.7比80.0±0.0,59.3±3.6比80.0±0.0,66.7±2.6比80.0±0.0,均P＜0.05);海马CA1区正常椎体神经元明显减少(个/HP:4.4±1.1比23.1±4.0,P＜0.05),神经元凋亡指数明显增加[(86.9±6.9)％比(3.4±0.8)％,P＜0.05],线粒体Cyt-C表达明显减少(A值:0.46±0.18比1.00±0.00,P＜0.05),胞质Cyt-C表达明显增加(A值:6.65±0.21比1.00±0.00,P＜0.05).mdivi-1组复苏后24h和48 h NDS评分较CA组有所提高(分:55.2±3.3比51.5±3.7,64.7±2.4比59.3±3.6,但均P＞0.05),72 h时NDS评分明显提高(分:74.5±2.3比66.7±2.6,P＜0.05);海马CA1区正常椎体神经元明显增加(个/HP:16.2±2.4比4.4±1.1,P＜ 0.05),神经元凋亡指数明显降低[(42.3±3.9)％比(86.9±6.9)％,P＜0.05],线粒体Cyt-C表达明显增加(A值:0.83±0.22比0.46±0.18,P＜ 0.05),胞质Cyt-C表达明显减少(A值:3.84±0.47比6.65±0.21,P＜ 0.05).DMSO组与CA组各指标比较差异均无统计学意义.结论 mdivi-1可能通过抑制CA-CPR大鼠线粒体途径的Cyt-C释放,以减少神经元凋亡,促进CPR后脑功能恢复.
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线粒体分裂抑制剂在海马神经元缺氧复氧损伤中的保护作用及机制
目的 探讨线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)在海马神经元缺氧复氧损伤中的保护作用及机制.方法 将体外培养的大鼠海马神经元采用随机数字表法分为正常细胞组(N组)、赋形剂组(V组)、缺血/再灌注组(I/R组)、Mdivi-1组(M组),利用氧糖剥夺法建立海马神经元缺氧复氧模型,缺氧6 h后复氧20 h,测定海马神经元线粒体内钙离子浓度、线粒体分裂相关蛋白(Drp1、Bcl-2、Bax、Cyt C)的表达含量及细胞凋亡率.结果 4组海马神经元线粒体内钙离子浓度比较,差异有统计学意义(P<0.05).N组、V组海马神经元线粒体内钙离子浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05);I/R组海马神经元线粒体内钙离子浓度高于N组、V组(P<0.05).M组海马神经元线粒体内钙离子浓度低于I/R组(P<0.05).4组Drp1、Bcl-2、Bax、Cyt C表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05).N组、V组Drp1、Bcl-2、Bax、Cyt C表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05).I/R组Drp1、Bax、Cyt C表达量高于N组、V组,Bcl-2表达量低于N组、V组(P<0.05).M组Drp1、Bax、Cyt C表达量低于I/R组,Bcl-2表达量高于I/R组(P<0.05).4组细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05).N组、V组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05);I/R组细胞凋亡率高于N组、V组(P<0.05).M组细胞凋亡率低于I/R组(P<0.05).结论 Mdivi-1可降低海马神经元线粒体内钙离子浓度,调控Drp1、Bax、Cyt C、Bcl-2表达,抑制线粒体分裂,降低细胞凋亡,从而起到脑保护作用.
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浅低温联合线粒体分裂抑制剂减轻全脑缺血-再灌注后线粒体损伤
目的 观察浅低温联合线粒体分裂抑制剂(mitochondrial division inhibitor 1, Mdivi-1)对大鼠海马缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤后线粒体的影响.方法 健康清洁级雄性SD大鼠40只,体重280～320 g,采用随机数字表法分为五组:假手术组(Sham组)、全脑IR组(IR组)、浅低温组(H组)、线粒体分裂抑制剂组(M组)和浅低温联合线粒体分裂抑制剂组(HM组),每组8只.采用经食管心脏起搏诱发心跳骤停+心肺复苏方法制备大鼠全脑IR损伤模型,即缺血4 min,再灌注6 h.Sham组不经历心跳骤停和心肺复苏,其余操作与IR组一致;H组和HM组于再灌注即刻体表降温,15 min之内将直肠温度降至32～34℃,自制变温箱维持6 h,其余组维持正常体温;M组和HM组于再灌注即刻静脉注射Mdivi-1(1.2 mg/kg),其余组注射等容积二甲基亚砜(DMSO).于再灌注6 h处死大鼠取双侧海马,采用Western blot法检测线粒体发动相关蛋白-1(dynamin-related protein 1, Drp1)和细胞色素C(cytochrome Cyt-C)蛋白含量,电镜下观察海马区椎体细胞中线粒体结构形态.结果 IR组、H组、M组和HM组Drp1和Cyt-C蛋白含量明显高于Sham组(P＜0.05);H组、M组和HM组Drp1和Cyt-C蛋白含量明显低于IR组(P＜0.05);HM组Drp1和Cyt-C蛋白含量明显低于H组和M组(P＜0.05),H组和M组Cyt-C蛋白含量差异无统计学意义.Sham组线粒体呈短棒状,结构清晰完整,其他各组中可见不同程度的线粒体分裂,膜间隙肿胀,基质包含物沉积,空泡形成,嵴模糊或消失,HM组病变较轻.结论 浅低温联合线粒体分裂抑制剂可以减轻大鼠全脑缺血-再灌注后线粒体损伤,联合效果优于单独应用.
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线粒体分裂抑制剂对脓毒症大鼠器官功能的保护作用
目的 观察线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)对脓毒症大鼠器官功能的保护作用.方法 采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制大鼠脓毒症模型,将120只体重为200～220 g的SD大鼠,随机分成假手术组、脓毒症组、常规治疗组、常规治疗+ Mdivi-1(1 mg/kg)治疗组(M1)、常规治疗+Mdivi-1(3 mg/kg)治疗组(M3),其中常规治疗组在CLP 12 h后从股静脉给予乳酸林格液输注,同时给予抗生素头孢呋辛钠(100 mg/kg)和血管活性药物多巴胺;M1组和M3组是在常规治疗液体中给予Mdivi-1 1 mg/kg和3 mg/kg从股静脉输注;脓毒症组在CLP 12 h后,股动静脉插管后放置;假手术组大鼠除不结扎盲肠和穿孔外,其余操作同模型组.观察各组对脓毒症大鼠肝脏、肾脏、肠道和心脏功能及动物存活时间、存活率的影响.结果 与假手术组比较,脓毒症后大鼠的器官功能明显受损,表现为谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)、肌钙蛋白T以及D-乳酸在脓毒症后均升高,与假手术组比较,差异有统计学意义;采用输液、抗感染以及血管活性药物常规治疗并不能明显改善大鼠的器官功能;不同浓度(1、3 mg/kg)的线粒体分裂抑制剂Mdivi-1联合常规治疗可明显改善肝脏、肾脏、肠道和心脏功能,其中3 mg/kg效果更好,与常规治疗组比较,AST为(152.2±11.8比216.5±14.7,P=0.000),ALT为(49.0±3.8比66.3±2.3,P=0.000)、BUN分别为(11.2±1.6比16.1±2.8,P=0.001),Cr为(23.6±2.5比35.7 ±2.7,P=0.000)、D-乳酸(D-lac)为(1.3±0.1比2.8±0.3,P=0.000);同时可提高组织氧供和氧耗,延长动物存活时间[(60.30 ±30.82)h比(11.28±20.77)h,P=0.000],提高存活率(8/16比1/16).结论 线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对脓毒症大鼠多器官功能有保护作用.
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线粒体分裂抑制剂对大鼠急性脊髓损伤后线粒体形态与功能的影响
目的 旨在检测选择性线粒体分裂抑制剂-1(Mdivi-1)预处理对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后线粒体形态,线粒体膜电位(MMP)及线粒体ATP含量的影响.方法 成年雌性SD大鼠72只,体重250～300 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为3组(n=24):假手术组(Sham组)、单纯脊髓损伤组(SCI组)和Mdivi-1预处理组(1.20 mg/kg,Mdivi-1组),每组24只.SCI组和Mdivi-1组大鼠采用Allen's方法制备ASCI模型,Mdi-vi-1组和SCI组大鼠在脊髓打击之前15 min经尾静脉分别给予Mdivi-1或等容量二甲基亚砜(DMSO).每组大鼠再分为两个亚组,分别于脊髓暴露或者打击后的3和12h处死,取出脊髓T9-1,采用透射电子显微镜检测线粒体形态,用荧光显微镜和荧光分光光度计检测MMP变化,用荧光分光度计检测线粒体ATP含量的变化.结果 与Sham组相比,SCI 3 h组时,线粒体数目明显减少(P＜0 01),截面积明显增大(P＜0.01),但MMP和线粒体ATP含量无明显变化;SCI 12 h组时,线粒体数目明显增多(P＜0.01),截面积明显减小(P＜0 01),但MMP和线粒体ATP含量明显减低(P＜0.01).与SCI组相比,Mdivi-1 3 h组时,线粒体数目、截面积及MMP和线粒体ATP含量无明显变化;而Mdivi-1 12 h组时,线粒体数目明显减少(P＜0.01),截面积明显增大(P＜0.01),MMP和线粒体ATP含量明显升高(P＜0.01).结论 选择性线粒体分裂抑制剂-Mdivi-1能有效抑制ASCI后线粒体分裂和MMP降低,增加线粒体中ATP的合成,从而保护了线粒体功能.
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线粒体分裂抑制剂改善大鼠海马神经元缺血再灌注损伤时的能量代谢障碍
目的 探讨线粒体分裂抑制剂(mdivi-1)在脑缺血再灌注损伤中对能量代谢的影响.方法 将体外培养8d的Wistar大鼠海马神经元分为4组:正常对照组、赋形剂组、mdivi-1组、缺血再灌注损伤组,后两组利用海马神经元氧糖剥夺法建立缺血再灌注损伤模型,mdivi-1组建模前给予mdivi-1预处理40 min.缺血6h再灌注20 h后应用Western blotting检测各组海马神经元线粒体分裂蛋白1(Drp1)、B细胞淋巴癌/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平,应用流式细胞术检测线粒体膜电位,应用酶标仪法检测三磷酸腺苷(ATP)含量及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性. 结果 与正常对照组比较,mdivi-1组和缺血再灌注损伤组Drp1 (1.001±0.276; 1.985±0.301)、Bax(2.752±0.786;4.225±1.107)表达水平明显升高,Bcl-2 (0.749±0.128; 0.336±0.109)表达水平明显降低,线粒体膜电位降低的细胞数(72.5％;92.7％)均升高,ATP含量[(74.129±5.773) μmoL/g蛋白;(36.986±5.945) μmoL/g蛋白]及Na+-K+-ATP酶活性[(4.348±0.451) U/mg蛋白;(1.709±0.477) U/mg蛋白]、CaV-Mg2+-ATP酶活性[(1.955±0.287) U/mg蛋白;(1.123±0.181) U/rag蛋白]以及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性[(15.445±1.699) nmol/(min· mg)、(17.065±1.070) nmol/(min·mg)、(32.123±1.652) nmol/(min ·rag)、(2.814±0.180) nmol/(min· mg); (6.810±1.725) nmol/(min· mg)、(9.473±0.751) nmol/(min· mg)、(23.010±1.716) nmol/(min· mg)、(1.598±0.181) nmol/(min· mg)]均明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与缺血再灌注损伤组比较,mdivi-1组Drpl、Bax表达水平明显减少,Bcl-2表达水平明显升高,线粒体膜电位降低的细胞数减少,ATP含量及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 mdivi-1可通过抑制线粒体分裂,有效地改善能量代谢障碍,从而减轻脑缺血再灌注损伤.
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线粒体分裂抑制剂在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制
目的 探讨线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)在大鼠脑缺血再灌注损伤线粒体凋亡过程中的保护作用及其机制. 方法 按随机数字表法将成年健康雄性Wistar大鼠60只分为假手术组、模型组和Mdivi-1预处理组,每组各20只,其中模型组和Mdivi-1预处理组大鼠采用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立脑缺血再灌注损伤模型,并于脑缺血前15 min预先尾静脉给予等容量二甲基亚砜和Mdivi-1(1.2 mg/kg).再灌注24 h后应用TUNEL法观察各组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况,SABC免疫组化染色检测细胞色素C(CytC)阳性细胞表达,Western blotting检测CytC蛋白表达,RT-PCR检测CytC mRNA表达. 结果 与假手术组比较,模型组神经细胞凋亡率、Cyt C阳性细胞率、Cyt C蛋白及mRNA表达水平(4.16％±0.25％vs 45.49％±0.77％；4.22％±0.20％vs55.12％±1.47％;0.395±0.002 vs 0.932±0.001;0.467±0.003 vs 0.789±0.009)显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).应用Mdivi-1预处理后神经细胞凋亡率、CytC阳性细胞率、CytC蛋白及mRNA表达水平(30.76％±0.51％; 35.07％± 1.42％; 0.594±0.002；0.523±0.004)较模型组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Mdivi-1通过阻断线粒体-Cyt C途径从而抑制细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤.
