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非经典的剪接位点(IVS1a+5g>a)及His348Gln双杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症
目的探讨遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症分子发病机制.方法检测凝血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对患者FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及3′,5′非翻译区进行分析,寻找基因突变,对有突变的序列反向测序证实;发生在非经典的剪接位点突变用外周血单个核细胞异位转录的RT-PCR方法确定其剪接方式.结果患者在8号外显子10 961位发生T→G杂合突变,导致348位His被Gln替代;在1号内含子5′端的非经典的剪接位点有Ggtgcg>Ggtgca(IVS1a+5g>a)杂合突变,RT-PCR结果揭示剪接过程中去除了2号外显子,却把3号内含子包含进去,在3号外显子起始处出现了移码突变,编码与原来氨基酸完全不同的9个氨基酸后出现了终止信号,产生了一个只有30个氨基酸组成的截短型蛋白.结论患者FⅦ基因中发现了两种杂合突变(10 961位T→G、IVS1a+5 g>a),其中后一种非经典的剪接位点突变导致的异常剪接方式为国际首次报道.
关键词： 遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症 基因突变 异位转录 -
一个新的剪接位点突变g.13776_13777insAGGT导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症
目的:对1例Ⅰ型抗凝血酶(AT)缺陷症患者及其家系进行表型诊断、基因分析及分子发病机制研究.方法:常规筛查检测AT缺陷症患者及其家系人员的凝血功能,采用血栓弹力图评估其高凝状态,用ELISA法检测抗心磷脂抗体(ACA)、抗β2GPI抗体,稀释的蝰蛇毒法检测狼疮抗凝物质(LA),发色底物法检测抗凝血酶(AT∶A)和蛋白C活性(PC∶A),凝固法检测蛋白5活性(PS∶A),荧光偏振免疫法测定同型半胱氨酸(Hcy),免疫比浊法定量检测抗凝血酶抗原(AT∶Ag),蛋白印迹分析血浆中AT的含量及相对分子质量,PCR法扩增AT基因的全部外显子及侧翼序列,DNA直接测序法进行基因分析.针对新的非经典剪接位点突变,提取患者的RNA,通过反转录反应结合巢式PCR扩增法,检测患者外周血中的AT异位转录本.结果:先证者的凝血筛查指标均正常,血栓弹力图指标显示其存在高凝状态,ACA、抗β2GPI抗体、LA、PC∶A、PS∶A及Hcy检测均正常；而其AT∶A和AT∶Ag同等下降,分别为45％和145 mg/L.血浆蛋白印迹检测结果显示,先证者血浆AT含量较正常混合血浆减少,但相对分子质量正常；基因分析发现,在5号内含子3’端剪接位点发生了杂合突变(g.13776_ 13777insAGGT)；巢式PCR产物直接测序检测到异位转录本,TA克隆分析发现,异常转录本与正常转录本的比例为1∶5.结论:剪接位点突变g.13776_13777insAGGT可导致AT基因异常转录,影响AT蛋白正常表达,导致该家系发生Ⅰ型遗传性AT缺陷症,此剪接位点突变为国际首次报道.
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纤维蛋白原α链剪切位点IVS2+1 G＞C突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症
目的:探讨遗传性低纤维蛋白原(Fg)血症的分子发病机制.方法:检测凝血指标以明确诊断:用DNA直接测序法对患者Fg基因FGA、FGB和FGG的所有外显子及其侧翼序列进行测序以寻找基冈突变,对有突变的序列反向测序证实;通过逆转录结合巢式PCR扩增的方法,检测患者外周血中的Fg异位转录产物;构建含有突变点的突变型FGA小基因(minigene)质粒和野牛型FGA小基因质粒,将2种质粒分别转染人胚肾(HEK)293T细胞.抽提RNA,逆转录PCR(RT-PCR)后TA克隆测序.结果:先证者呈FGA基因剪切位点IVS2+1G＞C杂合突变;对于该突变,逆转录结合巢式PCR的产物经克隆后测序只检测到正常转录本,而没有发现异常转录本:突变型FGA小基因质粒转染HEK293T细胞后,抽提RNA再经RT-PCR、TA克隆、测序,揭示剪接过程中发生了FGA基因2号内含子滞留.导致终止密码的提前出现,从而使异常转录的mRNA在体内很快被降解.结论:异位转录结合体外表达证明先证者FGA基因剪切位点IVS2+1G＞C突变导致异常转录mRNA在体内很快被降解,是先证者低Fg血症的原因之一.
