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重组pEGFP-C2-p100质粒构建及表达
目的:将人类p100基因定向连入pEGFP-C2质粒,使p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究p100蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法:采用EcoR I和BamH I双酶切方法,从pSG5-p100质粒中获得p100蛋白的cDNA全长;将该cDNA连接入pEGFP-C2质粒.将构建成功的pEGFP-C2-p100质粒转染入HeLa细胞.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见p100片段.(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)p1OO cDNA全长成功载入pEGFP-C2质粒.(2)p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.
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人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立
目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系.方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒.将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒.收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平.结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90％以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础.
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人p100蛋白:可增强STAT6基因转录活性的新因子
目的:建立可稳定表达人类p100蛋白的细胞株,研究细胞内p100蛋白参与STAT6介导的基因转录调控的机制.方法:利用免疫共沉淀法检测蛋白与蛋白间结合,荧光素酶法测定STAT6基因转录活性.结果:p100既可与STAT6结合,亦可与RBA多聚酶Ⅱ结合,并能增强STAT6介导的基因转录活性.结论:p100蛋白是STAT6共激活因子,可桥连STAT6和基本转录调控元件,促进STAT6介导的基因转录活性.
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p100蛋白表达抑制的 HepG2肝癌细胞稳定株的建立
目的 建立 p100 表达抑制的 HepG2 肝癌细胞稳定株,并初步探讨 p100 在 HepG2 肝癌细胞中的功能.方法 用脂质体将含有真核细胞筛选标记 Neo 和 GFP 的 p100 shRNA 表达质粒转染人 HepG2 细胞,检测 HepC2 细胞稳定株 HepG2(p1OOI) 中p100 表达的抑制效果;平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;MTS 检测细胞存活;划痕实验检测细胞迁移能力.结果 成功获得了p100 表达抑制的 HepG2 肝癌细胞稳定 HepG2(p100I),其中 p100 的表达明显降低.并且实验表明,该 plOO 表达抑制稳定的克隆形成能力,抵抗化疗药物 Cisplatin 诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞.结论 p100 表达抑制的 HepG2 肝癌细胞稳定株的建立为研究 p100 蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模,基于此稳定株的研究,发现 p100 能够影响 HepG2 肝癌细胞的多种细胞功能.
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重组pEGFP-C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达
目的 将6个不同的p100-TSN.Mutants基因片段分别定向连入PEGFP-C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础. 方法 利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切方法从6个pcDNA3.1 (+) -p100-TSN.Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN.Mutants的cDNA片段,将其连入pEGFP-C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 ①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN.Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论 ① 6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants重组质粒构建成功;② p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达.
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P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达
目的 分别将人类p100基因,p100 的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础.方法 PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI, 构建相应的3种重组质粒.将构建成功的质粒转染入HeLa 细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达.结果 ① PCR 法获得P100 基因序列, 长度为2 659 bp,SN基因片段1 918 bp,TD基因片段741 bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段, 将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达.结论 3种外源片段成功载入pERFP-CI质粒; P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.
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人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响
目的 构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒, 转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响.方法 设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(small hairpin RNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率.流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响.结果 成功构建了针对hP100 的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低.流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低.结论 RNAi(RNA interference, RNA 干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用.
