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M3受体在盐酸戊乙奎醚减轻内毒素诱导人肺微血管内皮细胞损伤中的作用
目的 评价M3受体在盐酸戊乙奎醚(PHC)减轻内毒素(LPS)诱导人肺微血管内皮细胞损伤中的作用.方法 正常人肺微血管内皮细胞和M3 shRNA转染人肺微血管内皮细胞,以1×105个∕ml的密度接种于6孔板(2 ml∕孔)或培养瓶(4 ml∕瓶)中,采用随机数字表法分为5组(n=5):对照组(C组)、LPS组、PHC+LPS组(P+LPS组)、LPS+M3 shRNA转染组(LPS+shRNA组)和PHC+LPS+M3 shRNA转染组(P+LPS+shRNA组).C组不给予药物处理;余各组均加入终浓度为0.1μg∕ml LPS;P+LPS组和P+LPS+shRNA组于加入LPS前1 h加入PHC 2μg∕ml;LPS+shRNA组和P+LPS+shRNA组以含2.5 nmol∕L M3受体shRNA的质粒转染细胞.加入LPS后1 h时,采用流式细胞仪测定内皮细胞纤维状肌动蛋白(F-actin)的含量;免疫荧光法检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达;Western blot法检测NF-κB p65和IκB的表达;ELISA法测定TNF-α和IL-6的含量;实时定量PCR法分别检测加入LPS后10、30和60 min时M3受体mRNA表达水平.结果 与C组比较,LPS组和P+LPS组F-actin含量降低,VE-cadherin和IκB表达下调,TNF-α和IL-6含量升高,MLCK和NF-κB p65表达上调(P<0.05);与C组比较,LPS组M3受体mRNA表达上调(P<0.05),P+LPS组差异无统计学意义(P>0.05);与LPS组比较,P+LPS组和LPS+shRNA组F-actin含量升高,VE-cadherin和IκB表达上调,TNF-α和IL-6浓度降低,MLCK、NF-κB p65和M3受体mRNA表达下调(P<0.05);与P+LPS组比较,P+LPS+shRNA组F-actin含量升高,VE-cadherin和IκB表达上调,TNF-α和IL-6浓度降低,MLCK、NF-κB p65和M3受体mRNA表达下调(P<0.05).结论 PHC可通过干扰M3受体,抑制NF-κB介导炎性反应,减轻LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤.
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M3受体在盐酸戊乙奎醚减轻内毒素致人肺微血管内皮细胞通透性增高中的作用:与MAPK信号通路的关系
目的 评价M3受体在盐酸戊乙奎醚减轻内毒素致人肺微血管内皮细胞通透性增高中的作用及其与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系.方法 将人肺微血管内皮细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板(2 ml/孔)或培养瓶(4 ml/瓶)中,采用随机数字表法分为6组(n=5):空白对照组(C组)、M3受体shRNA转染组(shRNA组)、脂多糖组(LPS组)、盐酸戊乙奎醚+脂多糖组(P+LPS组)、脂多糖+M3受体shRNA转染组(LPS+shRNA组)和盐酸戊乙奎醚+脂多糖+M3受体shRNA转染组(P+LPS+shRNA组).shRNA组、LPS+shRNA组和P+LPS+shRNA组以含2.5 nmol/L M3受体shR-NA的质粒转染细胞.LPS组和LPS+shRNA组于孵育24 h时加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS孵育1h;P+LPS组和P+LPS+shRNA组于孵育24 h时加入终浓度为2μg/ml的盐酸戊乙奎醚,孵育1h后加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS再孵育1h.采用Transwell法测定肺微血管内皮细胞通透性,采用Western blot法测定磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK 1/2)的表达水平,采用免疫荧光染色法测定热休克蛋白27 (HSP27)的表达水平,采用实时定量PCR法测定M3受体mRNA的表达.结果 与C组比较,shRNA组M3受体mRNA表达下调,LPS组细胞通透性增高,p-p38 MAPK、p-ERK1/2、HSP27、和M3受体mRNA表达上调(P＜0.05);与LPS组比较,P+LPS组、LPS+shRNA组和P+LPS+shRNA组细胞通透性降低,p-p38 MAPK、p-ERK1/2、HSP27和M3受体mRNA表达下调(P＜0.05);与LPS+shRNA组比较,P+LPS+shRNA组细胞通透性降低,p-p38 MAPK、p-ERK1/2、HSP27和M3受体mRNA表达下调(P＜0.05).结论 盐酸戊乙奎醚减轻内毒素致人肺微血管内皮细胞通透性增高的机制与其下调M3受体表达后抑制MAPK信号通路激活有关.
关键词： 受体 毒蕈碱M3 胆碱能药 内皮细胞 毛细血管 肺 内毒素血症 p38丝裂原活化蛋白激酶类 细胞外信号调节MAP激酶类 -
2型糖尿病大鼠膀胱M3受体改变的实验研究
目的研究病程3周的2型糖尿病大鼠膀胱M3受体含量及其基因转录水平的变化情况,探讨糖尿病性膀胱早期发病机制中逼尿肌M3受体的改变情况.方法2 d龄雌性Wistar大鼠随机分成2型糖尿病组和正常对照组,链脲佐菌素按90mg/kg体重腹腔注射并结合高糖高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型.于糖尿病病程3周时进行下列实验:反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测M3受体Mrna的含量;Western blotting方法检测膀胱M3受体蛋白的含量.结果RT-PCR方法检测结果显示:糖尿病组大鼠膀胱M3受体Mrna的数量显著高于正常对照组[(52.0±5.7)% vs(35.6±11.7)%,P＜0.05].Western blotting方法检测结果显示:糠尿病组大鼠膀胱M3受体含量显著高于正常对照组[(30.9±2.1)% vs(23.4±4.7)%,P＜0.01].结论本研究证实了糖尿病性膀胱早期M3受体的生物合成上调这一改变,从而解释了糖尿病早期膀胱逼尿肌收缩力增加这一现象.这可能是早期糖尿病性膀胱病变的一个发病机制.
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CHRM3基因T-149C多态性与2型糖尿病患者体重和血脂水平的关联研究
目的 探讨毒蕈碱乙酰胆碱受体亚型3(CHRM3)基因T-149C多态性与2型糖尿病发病风险及代谢紊乱的相关性.方法 用PCR-RFLP技术在573例上海地区汉族人中检测该基因位点的多态性,计算基因频率分布及比较不同基因型亚组间的各种临床代谢参数.结果 (1)基因频率分布在2型糖尿病组和正常糖耐量组之间的差异无统计学意义.(2)在2型糖尿病组中,TT基因型人群体重指数显著高于TC+CC基因型[(26.99±3.59vs 25.34±3.48)kg/m2,P=0.001].(3)2型糖尿病组体重指数≥25kg/m2亚组中TT基因型人群总胆固醇水平高于TC+CC型[(5.75±1.26 vs 5.27±1.14)mmol/L,P=0.030].结论 CHRM3基因T-149C多态位点可能参与2型糖尿病患者体重和脂代谢调节.
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ChRM3对胆管癌神经浸润的影响
目的 探讨毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(ChRM3)对胆管癌神经浸润的影响.方法 采用免疫组织化学方法检测60例胆管癌组织及30例正常胆管组织中ChRM3的表达水平;建立小鼠背根神经节(DRG)与胆管癌细胞RBE体外共培养模型,并加入ChRM3激动剂(匹罗卡品)及其拮抗剂(阿托品),通过观察神经纤维的生长和胆管癌RBE细胞对DRG和周围神经纤维的黏附及浸润,检测ChRM3在匹罗卡品和阿托品作用下对胆管癌RBE细胞浸润DRG及周围神经纤维的影响.结果 ChRM3在胆管癌组织中的阳性表达率高于正常胆管组织,差异有统计学意义(P<0.01).神经浸润在胆管癌中发生率为91.7％(55/60).DRG-RBE细胞共培养模型中加入匹罗卡品后,RBE细胞浸润DRG及周围神经纤维的细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),这种作用在加入阿托品后明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05).而将阿托品单独作用于胆管癌组织,神经浸润结果与对照组比较无明显差异(P>0.05).结论 ChRM3参与了胆管癌神经浸润过程,可能为抑制胆管癌的神经浸润提供了新治疗靶点.
