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EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建
①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.
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BARF1基因转染对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响
①目的 探讨EB病毒编码BARF1基因对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响.②方法 用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆.用免疫组化法检测转染细胞及未转染细胞Bcl-2的表达状况.③结果 获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的细胞Bcl-2表达显著高于未转染和转染空载体GES-1细胞(P＜0.01).④结论 BARF1基因可能上调了人胃上皮细胞Bcl-2表达.
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EB病毒基因BARF1在鼻咽癌细胞中的表达及意义
目的:探讨EB(Epstein-Barr)病毒新基因BARF1(BamHI A rightward open readingframe 1)在人鼻咽癌组织中的表达及意义,为深入阐明EB病毒致癌机制提供实验依据.方法:提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增标本中的EBNA1(EB virus associated nuclear antigen 1)和BARF1 mRNA,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察并照相.结果:11例RNA合格的标本均表达EBNA1,提示病例均为EB病毒阳性病例;其中9例表达BARF1,占82%;而且9例中的7例为强阳性.结论:EB病毒新基因BARF1 mRNA在鼻咽癌细胞中高表达,这提示除了已经明确的潜伏性膜蛋白1(LMP1)以外,BARF1可能在鼻咽癌细胞恶性增殖中发挥重要作用,具体机制有待深入研究.
关键词： 鼻咽癌 Epstein-Barr病毒 BARF1基因 -
BARF1基因的启动子活性及其在鼻咽癌细胞中肿瘤特异性分析研究
目的 探讨BARF1基因的启动子活性及其在鼻咽癌细胞中是否具有肿瘤相对特异性.方法 结合启动子预测软件结果(TRANSFAC和MATINSPECTOR)及引物设计软件(Primer premier 5.0),设计BARF1基因的启动子序列,验证其启动子活性,并比较该启动子在NP69细胞和CNE-2细胞中的的启动子活性的差异,验证其肿瘤相对特异性.结果 测序和酶切结果证明所设计的BARF1基因的启动子的序列完全正确,其在CNE-2细胞中具有启动子活性,而在NP69细胞中不具备启动子活性,且该启动子在CNE-2细胞中的启动子活性远高于NP69细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究设计的BARF1基因的启动子具有启动子活性,且该启动子具有肿瘤相对特异性.
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携带BARF1基因的人胃上皮细胞株的建立
目的 建立携带BARF1基因的人胃上皮细胞株,为探讨EB病毒编码BARF1基因对胃上皮细胞的影响而建立体外模型.方法 构建携带BARF1基因的真核载体pcDNA3.1(+)-his/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆.用CCK-8检测未转染的GES-1、转染空载体GES-1及转染BARF1基因的GES-1增殖状况.结果 双酶切鉴定,666bp的BARF1基因片段已连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his.转染细胞通过G418筛选,获得了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的GES-1细胞增殖速度显著高于未转染的GES-1和转染空载体GES-1细胞(P＜0.01).结论 建立了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株.
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EB病毒亲上皮性基因BARF1研究进展
Epstein-Barr病毒是一种与人类肿瘤有密切关系的DNA病毒,BARF1编码蛋白被认为是除LMP1外的另一个具有致瘤作用的病毒蛋白,可促使上皮细胞永生化和转化,并参与免疫调控,与上皮细胞性肿瘤如鼻咽癌和胃癌的发生发展有关.
关键词： Epstein-Barr病毒 BARF1基因 -
EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义
目的 EB病毒与鼻咽癌(特别是低分化鳞癌)密切相关.BARF1基因是EBV裂解期中的早期基因,本研究通过检测BARF1基因在鼻咽癌组织中的表达,希望能进一步揭示EB病毒与鼻咽癌的关系及致癌的可能机制.方法对经病理确诊的47例鼻咽低分化鳞癌病人分别取癌组织、癌旁组织及相对正常鼻咽黏膜和 13例其他头颈部恶性肿瘤癌组织及8例正常人鼻咽黏膜组织(均证实有EB病毒潜伏感染),采用巢式-PCR技术检测BARF1在这些组织中的表达情况.结果鼻咽癌组织BARF1基因表达率为 91.5%(43/47),其中39例相对强表达,4例弱表达;癌旁组织BARF1基因表达率为 46.8%(22/47),其中11例相对强表达,11例弱表达;相对正常黏膜BARF1基因表达率为 6.4%(3/47),3例均为弱表达;携带EB病毒的其他头颈部恶性肿瘤组织、正常人鼻咽黏膜组织均未检测到BARF1基因表达.结论从相对正常鼻咽黏膜到癌旁组织再到鼻咽癌组织BARF1基因的表达趋势为从不表达到表达,从弱表达到强表达.说明EB病毒与鼻咽癌的发生确实存在密切相关性;提示启动BARF1基因的表达有可能是EB病毒致鼻咽癌的重要条件之一.
