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多重置换扩增在植入前遗传学诊断中的应用及展望
多重置换扩增是一种新兴的全基因组扩增技术,能对单个细胞进行全基因扩增,产生大量的优质DNA,具有高扩增效率和高保真性等特点.多重置换扩增联合常规PCR已被成功用于植入前遗传学诊断,进一步扩展了后者的应用范围.
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多重置换扩增方法在无创性产前基因诊断中的应用
目的 探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法 应用到杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)的无创性产前基因诊断中的可行性. 方法对12例孕7～25周的孕妇外周血用Percoll不连续密度梯度离心初步富集、甩片后,用Kleihauer抗酸染色法标记胎儿有核红细胞.显微操作法获取阳性细胞后,进行多重置换扩增,得到的全基因组扩增产物直接作为模板进行性别鉴定及短串联重复序列连锁分析检测,验证有核红细胞的来源,同时进行DMD的无创性产前基因诊断.结果 经多重置换扩增后的产物进行琼脂糖电泳,显示片段长度大于15 kb.应用多重置换扩增方法对12例孕有DMD高风险患儿的孕妇进行了无创性产前基因诊断,诊断结果与引产或产后反馈相一致. 结论 多重置换扩增能从微量模板中扩增出大量均一、完整的胎儿基因组序列 ,确保了无创性产前基因诊断结果的准确性.
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单细胞水平检测von Hippel-Lindau病基因突变的实验研究
目的 建立单细胞水平检测von Hippel-Lindau病基因(VHL)突变的实验方法.方法 单个淋巴细胞基于多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)的全基因组扩增后进行常规PCR后测序和实时荧光定量PCR,结合各荧光的终点变化判断对应的等位基因存在与否.结果 MDA后单细胞扩增效率为90.91%,污染率为0;通过测序,患者VHL等位基因的脱扣率为26.67%,诊断正确率为73.33%;通过结合相应荧光的终点变化判断患者VHL基因的等位基因的脱扣率为16.67%,正确率为83.33%.结论 单细胞MDA后常规PCR后测序及实时荧光定量PCR能够特异、准确地检测单个淋巴细胞的VHL基因型,两者的联合应用有助于提高检测的准确性.
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短串联重复序列在染色体罗氏易位植入前遗传学诊断的应用
目的:采用多重置换扩增(MDA)结合短串联重复序列(STR)建立一种基于PCR技术诊断染色体罗氏易位的植入前遗传学诊断(PGD)方法.方法:选择位于易位染色体上的STR位点,对家系采用荧光PCR进行分析,选择有多态性的位点,再采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,根据家系分析的结果,对具有多态性的STR位点进行分析诊断.结果:对3个家系进行了4个取卵周期(3个PGD周期),每个家系分别采用7～ 15个具有多态性的STR位点进行分析,共对24个胚胎进行诊断.PGD的诊断效率为95.8％ (23/24),平衡胚胎占52.2％(12/23),异常胚胎占47.8％(11/23),共移植了6个胚胎,获得2例临床妊娠,临床妊娠率为66.7％(2/3),出生了2个健康婴儿,染色体核型均正常.结论:采用依赖于STR的PCR分析法可以用于染色体罗氏易位的PGD.
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多重置换扩增在含抑制物检材中的应用
目的：研究多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）在含抑制物检材中的抗抑制能力，与磁珠法纯化检材相比较，证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合，分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组，PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并应用AmpF?STR?IdentifilerTM Plus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1 ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1 ng/μL时，空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物；磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1 ng/μL时，不能够得到扩增产物；MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增，完全不受抑制物影响。结论 MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用，其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA，具有一定的法医学应用意义。
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多重置换扩增在病理切片DNA分型中的应用
目的 探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术应用于法医学组织病理切片DNA分型的可行性. 方法 采用重复拉丁方设计实验,按保存时间、组织类型、尸源年龄3个因素分7个水平进行随机分组,共制作98例病理切片.硅珠法制备DNA模板,对照组直接采用AmpFeSTR@IdentifilerTM试剂盒进行PCR扩增,实验组进行MDA后再进行扩增.以新鲜尸体组织的分型结果为标准,对比分析切片实验组与对照组的基因座检出数与检出率. 结果 各保存时间切片实验组与对照组的基因座检出率相比差异有统计学意义(P＜0.01)；组织切片保存时间为360d以内,实验组的16个基因座检出率均可达到95％以上.各组织类型间的差异具有统计学意义(P＜0.01),而尸源年龄组间差异无统计学意义(P＞0.01).结论 MDA可提高病理切片模板基因组量,相对降低PCR扩增抑制物浓度,减少等位基因脱扣现象,有效提高基因座检出率,MDA在法医切片DNA分型中具有运用价值,但应注意切片保存时间与组织类型等因素对分型结果的影响.
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混合斑中精子细胞分离及其DNA制备方法
目的 尝试建立一种检测混合斑中精子细胞的方法.方法 使用显微操作法捕获精子细胞,全基因组扩增(多重置换扩增)精子细胞DNA.结果 对10管精斑检材的全基因组扩增,获得了高产、保真的产物.使用50μL体系对20个精子细胞直接进行全基因组扩增,省去了对起始模板的纯化过程,DNA扩增倍数达30000倍以上,片段长度大多在15 kb以上,其STRs复合扩增分型结果有可参照性.结论 显微操作法可以有效捕获精子细胞,排除干扰,多重置换扩增可以提供足够量的产物用于法医DNA分析,该方法具有可行性.
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全基因组扩增法应用于低拷贝数DNA检测
目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析.方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型.结果10pg DNA模板经全基因组扩增后,能够进行DNA分型.结论全基因组扩增可以用于LCN的DNA分析,帮助提高微量物证的检出成功率.
