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单细胞微阵列比较基因组杂交技术在胚胎植入前遗传学筛查中的应用
目的 建立利用单细胞微阵列比较基因组杂交(array CGH,aCGH)技术进行胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术平台,并应用aCGH技术进行PGS获得持续妊娠. 方法 采集废弃胚胎来源卵裂球10个,核型正常男性(46,XY)淋巴细胞3个,通过单细胞全基因组扩增后,利用aCGH技术进行染色体非整倍体分析；在此基础上,将aCGH技术应用于临床一例反复流产患者. 结果 3个淋巴细胞及9个废胚来源卵裂球的全基因组扩增成功,1个废胚来源卵裂球扩增失败,扩增成功的样本通过aCGH检测后均获得明确的诊断,3个淋巴细胞分析结果与已知核型一致；临床病例5个胚胎活检的单卵裂球均得到明确诊断,移植1枚正常整倍体胚胎后获得临床持续妊娠. 结论 在胚胎植入前遗传学筛查中,单细胞aCGH技术能全面地评估胚胎染色体组情况,可应用于临床PGS.
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联合SNaPshot和单倍型分析技术建立G6PD缺乏症单细胞基因诊断体系
目的 建立可有效监测污染和等位基因脱扣(allele dropout,ADO)的可靠的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症单细胞基因诊断体系. 方法 获取正常G6PD基因型个体及G6PD基因突变杂合子的单个淋巴细胞,在全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)的基础上,应用多重SNaPshot技术检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点,同时联合针对Xq28上6个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点的单倍型分析技术辅助分析结果. 结果 共检测60个正常和96个杂合子单淋巴细胞,WGA扩增效率为94.23％,成功扩增的WGA产物在后续基因检测的总扩增效率和总ADO率分别为89.37％和13.74％;8个基因位点的扩增效率和ADO率均有统计学差异(P总＜0.05);发生G6PD基因ADO的15例G6PD杂合子单淋巴细胞中,均未同时出现6个STR位点全部扩增失败或ADO现象;所有样本的STR位点检测结果除目的片段的信号峰外,均未出现其他峰信号. 结论 联合SNaPshot和单倍体分型技术所建立的单细胞G6PD基因诊断体系,在G6PD基因分型的同时,还可提示是否存在污染或ADO,大程度保证诊断结果的可靠性,减少误诊率,可望取代传统的性别选择,实现真正意义上的G6PD缺乏症植入前遗传学诊断.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 植入前遗传学诊断 全基因组扩增 单倍型分析 等位基因脱扣 -
全基因组扩增在DMD植入前遗传学诊断中的可行性研究
目的:建立单细胞扩增前引物延伸法及巢式PCR技术,研究该技术在杜氏肌营养不良症植入前遗传学诊断中的可行性.方法:获取单个正常男女淋巴细胞和无杜氏肌营养不良(DMD)家族史的单个卵裂球,15碱基随机引物PEP扩增单细胞全基因组,再以巢式PCR技术检测PEP反应产物中DMD基因外显子8,17,19,44,45,48及Y染色体上的皋丸决定基因SRY.结果:单个淋巴细胞和单个卵裂球的6个DMD外显子扩增成功率分别为97.2%(175/180)和100%(60/60),单个男性淋巴细胞SRY的扩增成功率为100%(15/15),而单个女性淋巴细胞无SRY的扩增(0/15).结论:检测单细胞DMD基因外显子8,17,19,44,45,48和SRY的PEP-巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,可望应用于DMD的植入前遗传学诊断的单细胞基因诊断中.
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兔球虫 PCR 检测方法的改进和应用
兔球虫病由艾美耳属球虫寄生于消化道而引起，对养兔业的危害极大。由于兔艾美耳球虫的11个虫种在致病性上有较大差异，因此进行准确的虫种鉴定对兔球虫病的诊断和防治有十分重要的意义。为提高和扩大PCR方法检测粪便样品中艾美耳球虫的灵敏度和应用范围，我们利用全基因组扩增技术对提取自粪便样品的球虫基因组进行预扩增，提高PCR反应初始模板含量，再利用兔艾美耳球虫ITS-1序列种特异性引物对WGA产物进行PCR扩增，以鉴定虫种。结果显示，经全基因组扩增后的样品的PCR检测能够在单个卵囊的水平上进行虫种鉴定。利用该方法，我们对10份卵囊含量较少的田间兔粪样品进行了PCR检测，对其中的虫种进行了的鉴定。检测结果显示，与卵囊形态鉴定相比，该方法不仅与能确定形态的形态学检测结果一致，还能够检测出形态学不易判断的虫种，体现了更高的准确性。该技术的应用可提高田间样品检测的敏感性和准确度，为兔球虫临床感染情况提供实践指导。
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从粪便中分离隐孢子虫用于全基因组测序的研究
目的 使用新的方法直接从少量粪便样品中分离和纯化隐孢子虫卵囊,并进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),从而获得符合全基因组测序要求的隐孢子虫DNA. 方法 10份新鲜牛源隐孢子虫粪便样品,用蔗糖和氯化铯离心法分离卵囊,然后使用免疫磁珠试剂盒纯化;用漂白水进行卵囊表面消毒,以除去细菌及真菌等病原微生物.采用QIAamp DAN Mini kit试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI kit试剂盒进行WGA,后,采用定量PCR对基因组DNA进行量和纯度检测. 结果 分离纯化后的卵囊计数为2.81×104个/g～2.90×107个/g.提取基因组DNA后进行WGA,所有扩增产物均为大分子片段,表明WGA成功.WGA产物的DNA浓度为55.3ng/μl～357.5 ng/μl.隐孢子虫SSU rRNA基因的定量PCR扩增显示,10份样品纯化WGA产物的CT值范围为9.75～17.76,其中有7个样品CT＜15,满足全基因组测序要求. 结论 直接从粪便中分离和纯化隐孢子虫卵囊再进行WGA,可使隐孢子虫的基因组DNA浓度和纯度能达到测序要求,该方法使隐孢子虫全基因测序常规化是可行的.
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基于单细胞的分子技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用
自1989年胚胎植入前诊断技术首次成功应用以来,胚胎植入前遗传学检测技术(PGT)在分子诊断技术改革的推动下迅速发展及推广.作为一种更早期形式的产前诊断,PGT通过对辅助生殖周期中体外培养的胚胎细胞进行致病基因突变的检测或染色体异常的筛查,从而筛选优质胚胎,以提高辅助生殖成功率.PGT涉及生殖医学领域的辅助生殖技术、医学检验领域的分子检测技术以及胎儿医学领域的遗传咨询技术.本文将立足于检验医学的角度,对分子检测技术在PGT领域的应用和进展进行阐述,并探讨其未来的发展方向.(中华检验医学杂志,2018,41:270-274)
关键词： 胚胎植入前遗传学检测 胚胎活检 全基因组扩增 新一代测序 -
胃癌中18号染色体的杂合性丢失研究
目的:检测原发性胃癌组织中18号染色体的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)情况.方法:联合应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)-高可信度全基因组扩增(high fidelity-Whole genomeamplification,HF-WGA)-变性高效液相色谱(denaturedhigh pressure liquid chromatography,DHPLC)方法,检测胃癌中18号染色体上短插入/缺失多态(short insertiondeletion polymorphism,SIDP)标记的LOH.结果:在所检测的10例胃癌组织中3例呈现SIDP位点LOH(30%);9个SIDP位点中3个(MID148、MID150和MID352)发生LOH,其中MID150位点LOH见于3例胃癌组织.在1例胃癌组织中3个SIDP位点同时呈现LOH.结论:联合应用LCM和HF-WGA,经DHPLC分析SIDP标记,可进行肿瘤细胞中LOH检测.本研究为18号染色体上胃癌相关抑癌基因的研究提供一种新技术策略.
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胃癌癌前病变相关基因的筛查及表达研究
目的:胃黏膜异型增生是一种公认的重要癌前病变,筛查癌前病变相关基因并研究这些基因在胃癌不同阶段的表达,探讨胃癌发生分子机制.方法:手工显微切割取胃异型增生和正常组织,应用cDNAPCR方法对少量组织全基因组扩增后进行双向抑制性消减杂交,消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索.应用斑点杂交检测基因在胃癌不同阶段的表达,并用半定量RT-PCR方法进一步验证检测结果.结果:正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了两个cDNA消减文库,测序的26个克隆中21个片段在胃癌不同阶段有表达异常,特别是其中4个基因(P125,cytochrome coxidase subunitI,meprin A,acidic calponin)在异型增生、早癌、进展期胃癌中皆有表达改变,可能是重要的胃癌癌前病变相关基因.结论:发现4个新的与胃癌发生相关基因,其具体机制有待进一步研究.
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应用aCGH技术建立胚胎植入前遗传学筛查
目的 应用微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)对移植前胚胎进行染色体遗传学筛查,建立胚胎染色体非整倍体检测方法.方法 对冷冻囊胚、对照质控品先进行全基因组扩增,然后再继续aCGH检测.结果 4个冷冻囊胚中1个染色体正常,另外3个染色体异常,对照质控全部检测出.结论 应用全基因组扩增以及aCGH技术,对囊胚成功进行了植入前遗传学筛查,能够全面评估胚胎染色体的非整倍体情况,为复发流产患者提高生殖成功率提供重要依据.
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高通量测序技术在胚胎植入前诊断中的应用
随着辅助生殖技术的迅速发展,胚胎植入前诊断的方法也更加快速、准确.随着全基因组扩增技术的完善、胚胎玻璃化冷冻技术的成熟,高通量测序技术开始应用于胚胎植入前诊断,并凭借着通量大、速度快、准确度高、价格经济等优势得到越来越多的关注和研究.现在不仅能对胚胎的全基因组染色体异常进行筛查,还能对单基因病进行诊断,选择植入健康的胚胎.胚胎活检技术和高通量测序技术正在不断的发展和进步,未来可能在不损伤胚胎的情况下就能对胚胎的遗传情况进行准确的检测.
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植入前诊断的现状和发展
植入前诊断(PGD)技术的应用已有10年,其所采用的基本技术包括胚胎活检、聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH).随着分子诊断技术的发展,现在又有了荧光PCR、多重PCR和全基因组扩增等,并且许多研究者用五种甚至更多探针检测染色体异常.未来具有发展前景的分子技术包括定量PCR、DNA指纹和微阵列技术,其中用于分析单个细胞染色体的新技术包括已用于临床的分裂间期核转变和仍有待完善的比较性基因组杂交.这些技术都能在单细胞水平诊断多种疾病并使诊断结果更精确.
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多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
多重置换扩增技术(MDA)是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点.尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)实验研究和临床应用中仍取得巨大进展.MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断.
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全基因组扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
全基因组扩增技术是一种对微量DNA进行均衡扩增的方法,用于各类遗传检测,对于获取细胞数目及DNA量非常有限的植入前遗传学诊断是十分可贵的.该项技术主要包括经热循环扩增和恒温扩增两类方法,其中恒温扩增的多重置换扩增法为近几年发展起来的技术,目前多重置换扩增法在植入前遗传学诊断中的应用正备受关注.对全基因组扩增技术的常用方法,尤其对多重置换扩增法及其在植入前遗传学诊断中的应用现状做综述.
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全基因组扩增技术的研究进展
全基因组扩增可增加微量DNA分析的遗传信息量,为实现微量DNA多基因位点分析和重复检测提供了可能,目前已应用于植人前遗传学诊断、母体外周血胎儿细胞产前遗传学分析,及肿瘤基因分析等领域研究,是一项非常有价值的技术.
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全基因组扩增技术新进展及其法医学应用现状
微量模板DNA的检测,是很多领域迫切需要解决的一个难题.因为DNA量不足,用现有的技术手段常无法检测成功.全基因组扩增技术可对非常微量的DNA进行均衡的扩增获得大量DNA,故被认为是目前解决这一难题的一种基本方法,已被广泛用于法医学、单基因遗传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究,并取得了良好的效果.现对这一技术的新研究进展及其在法医学方面的应用现状作一综述.
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无创性产前基因诊断研究新进展
无创性产前基因诊断是运用母体外周血中的胎儿细胞进行产前诊断的一种方法，它避免了侵入性产前诊断方法带来的危险性，是产前诊断研究领域的革命性技术。本文概述了该技术的原理、基本方法及新进展。
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两种全基因组扩增方法用于微量检材STR基因座分型比较
目的 应用多重置换扩增(MDA)技术和改进型扩增前引物延伸(IPEP)技术对法医学微量DNA进行全基因组扩增,比较两种方法的STR分型效果及法医学应用价值.方法 用MDA、IPEP方法分别对不同模板量DNA进行扩增,扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR Identifiler(R)试剂盒检测基因型.结果 MDA方法可对模板DNA增加103～106倍,IPEP方法可增加25～310倍.为获得完整准确的分型结果,MDA低需1 ng基因组DNA,IPEP低需0.05 ng基因组DNA.当基因组DNA为0.01 ng～0.1 ng时,IPEP产物、MDA产物的平均基因座检出数均高于未经全基因组扩增的DNA,其中IPEP产物的平均基因座检出数高于MDA产物.结论 MDA方法、IPEP方法均可提高微量检材的STR分型效果.MDA方法的产量高于IPEP方法;IPEP方法的灵敏度高于MDA方法,且对微量DNA的STR分型效果优于MDA方法,因此更适于法医学痕量DNA检测.
关键词： 多重置换扩增反应 改进型扩增前引物延伸反应 全基因组扩增 STR分型 -
滚环扩增原理及其在医药领域的应用
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法.这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力.本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用.
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改良扩增前引物延伸技术检测痕量DNA
痕量DNA又称低拷贝模板(low copy number,LCN).Gill等[1]初对其定义为少于100 pg的DNA模板.现有的PCR-STR方法,虽从一定程度上解决了微量模板DNA分析的难题,但对于痕量DNA仍很难检测成功.
关键词： 改良的扩增前引物延伸反应 全基因组扩增 痕量DNA检测 -
临床标本中未知病毒基因芯片检测方法探索
目的 探索可用于检测临床标本中未知病毒的基因芯片技术.方法 设计合成1～4型登革病毒基因芯片探针,制备成登革病毒基因芯片.提取1～4型登革病毒标准毒株的核酸RNA,以phi29 DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物进一步用登革病毒芯片进行杂交检测,随后用广州白云机场出入境检验检疫局国境口岸收集的登革热病人血清标本对新建立的方法进行验证.结果 1～4型登革病毒标准毒株培养液提取的RNA,经扩增、标记及芯片杂交检测,相应探针阵列均可检测到明显杂交信号,探针阳性率均达100％；从3份临床登革热病人血清标本中提取的RNA,同样也可得到明显的杂交信号,而背景干扰信号很低,从相应达到100％探针阳性率的探针阵列可判断,3份病人血清标本中分别为含1、2、3型登革病毒.结论 该研究新建立的基因芯片方法,可用于检测临床血清标本中的登革病毒,如果设计更多针对不同病原体的特异性芯片探针,该方法还可用于临床标本中一些未知病原体的鉴定.
