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单细胞转录组测序的方法原理及应用
常规的转录组分析方法通常需要103个细胞,所以无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性,也难以对诸如早期胚胎及异质性的组织干细胞和肿瘤干细胞等极少量细胞进行分析,而单细胞转录组测序技术的出现为此提供了有效的研究工具.单细胞转录组测序技术是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项新技术.本文主要就单细胞转录组测序技术的操作方法、应用成果以及进展作一综述.
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实验模型下两种全基因组扩增技术对指纹DNA检验的效能
目的 对简并寡核苷酸引物PCR(Begenerate oligonueleofide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(Primer extension pre-amplification PCR,PEP - PCR)用于指纹检材DNA检验的价值进行研究. 方法 建立2种指纹检材DNA模型,分别用普通PCR、DOP技术和PEP技术三种方法对指纹DNA样本进行STR分型,对三种方法的效能进行比较评价.结果 实验模型1条件下,三种方法均不能获得满意分型结果；模型2条件下,DOP和PEP两种方法可以增加STR分型的成功率和信息量.结论 DOP和PEP技术必须结合高效的DNA提取技术才能大程度发挥其检验效能.
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应用全基因组扩增结合二代测序技术对废弃胚胎进行植入前遗传学筛查
目的 应用全基因组扩增结合二代测序技术对废弃胚胎进行植入前遗传学筛查.方法 收集476个废弃胚胎,经继续培养后获得23个优质囊胚.根据Gardner囊胚分级法,对4BC级及以上的囊胚进行活检,在有部分滋养外胚层细胞孵出时用活检针吸取5～10个细胞,于全基因组扩增后进行二代测序,检测胚胎中有无染色体片段的缺失/重复以及染色体数目变异.结果 23个囊胚共吸取滋养外胚层细胞148个.进行单细胞全基因组扩增后,选取其中60个扩增产物进行高通量测序,结果显示有39个细胞染色体存在异常,来源于14个囊胚,即囊胚异常比率为60.87％(14/23).结论 应用全基因组扩增结合二代测序技术对废弃胚胎进行植入前遗传学筛查分析,可筛除染色体非整倍体及染色体结构异常的胚胎,对于改善高危人群试管助孕的效果和减少出生缺陷具有重要的意义.
关键词： 胚胎植入前遗传学诊断/筛查 废弃胚胎 囊胚 全基因组扩增 二代测序 -
囊胚培养在植入前遗传学诊断中的价值
目的 探讨囊胚培养在植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)中的应用价值.方法 受精后第3天(Day 3)行胚胎活检,进行荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH).对于诊断为正常的胚胎,培养到囊胚阶段后选择形态评分优良的囊胚进行移植;对于诊断为异常的胚胎,有14个培养到囊胚阶段,各取其一部分细胞用于全基因组扩增(whole genomic amplification,WGA),将扩增后的DNA用微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,arrayCGH)进行再次检测.结果 FISH诊断为正常的6个囊胚进行了5个周期的胚胎移植,3个周期成功生育了4个健康婴儿,1个周期单胎妊娠见胚囊后流产,绒毛染色体检测为正常核型.FISH诊断为异常的14个囊胚用array-CGH技术检测发现有6个为正常结果.结论 FISH检测结合囊胚培养后移植可能可以进一步保证PGD结果的准确性.囊胚培养后的检测可能能够避免Day 3检测假阳性结果或者嵌合的干扰,从而更真实的反映整体胚胎的情况.
关键词： 囊胚培养 植入前遗传学诊断 荧光原位杂交 全基因组扩增 微阵列比较基因组杂交 -
应用全基因组扩增技术对β-地中海贫血进行胚胎植入前遗传学诊断
目的探讨对β-地中海贫血进行胚胎植入前遗传学诊断的方法.方法夫妇双方分别为β41-42(-TCTT)及IVS-Ⅱ 654(C→T) 突变杂合子,在本中心进行体外受精-胚胎移植和胚胎植入前遗传学诊断.结果 13个胚胎中共有11个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,正常胚胎2个(18.1%);杂合子胚胎6个(54.5%);双重杂合子胚胎3个(27.3%).共移植3个胚胎,其中2个正常胚胎、1个杂合子胚胎.在胚胎移植后5周 B超示三胎妊娠,孕8周自然减一胎,并于孕20周时经产前诊断,证实均为健康胎儿.现已分娩双胎分别为正常和杂合子.结论成功应用全基因组扩增技术对β-地中海贫血进行胚胎植入前遗传学诊断,并分娩健康双胎.
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多重置换扩增在植入前遗传学诊断中的应用及展望
多重置换扩增是一种新兴的全基因组扩增技术,能对单个细胞进行全基因扩增,产生大量的优质DNA,具有高扩增效率和高保真性等特点.多重置换扩增联合常规PCR已被成功用于植入前遗传学诊断,进一步扩展了后者的应用范围.
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改良IPEP法用于痕量DNA检测的实验研究
目的 探讨改良扩增前引物延伸(IPEP)法对痕量DNA样本STR检测分型的效果.方法 用改良IPEP法对痕量样品DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR(R) Indentifiler(R)试剂盒作基因型检测.结果 该方法可增加模板DNA约200～1100倍.基因组DNA不低于0.025ng时,可获得15个STR基因座和Amelogenin性别基因座的分型结果.基因组DNA 0.01～0.025ng时,可获得9个以上基因座的分型结果.结论 改良IPEP法可有效提高痕量DNA样本STR分型检验的灵敏度,有较好的实用价值.
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毛干及自然脱落毛囊复合扩增Amel及13个STR基因座检验的实验研究
刑事案件案发现场往往会遗留有毛发.人为拔下的毛发,毛囊用常规方法一般可成功检见Amel及STR基因座,达到同一认定,毛干可进行mtDNA检验.
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全基因组扩增在微量检材DNA分型中的应用
目的 探索全基因组扩增技术对微量检材DNA分型的有效性.方法 通过显微操作制备含1～20个细胞的模拟微量检材样本,在常规PCR-STR分型前加入全基因组扩增步骤,从等位基因不平衡、等位基因丢失、基因座丢失、伪等位基因(包含stutter峰)等方面探究PEP和MDA两种全基因组扩增方法对微量检材DNA分型的有效性.结果 MDA扩增效率高于PEP,但等位基因丢失和伪等位基因严重;PEP方法的正确分型率高于MDA,但小片段DNA优势扩增现象较严重.结论 MDA方法并不适合目前以STR分型为主导的法庭科学,当微量检材样本的绝对量相当少时,可以考虑使用PEP方法来扩大样本量,以满足重复检验的要求,但可能面临大片段DNA扩增失败的风险.
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混合斑中精子细胞分离及其DNA制备方法
目的 尝试建立一种检测混合斑中精子细胞的方法.方法 使用显微操作法捕获精子细胞,全基因组扩增(多重置换扩增)精子细胞DNA.结果 对10管精斑检材的全基因组扩增,获得了高产、保真的产物.使用50μL体系对20个精子细胞直接进行全基因组扩增,省去了对起始模板的纯化过程,DNA扩增倍数达30000倍以上,片段长度大多在15 kb以上,其STRs复合扩增分型结果有可参照性.结论 显微操作法可以有效捕获精子细胞,排除干扰,多重置换扩增可以提供足够量的产物用于法医DNA分析,该方法具有可行性.
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全基因组扩增法应用于低拷贝数DNA检测
目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析.方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型.结果10pg DNA模板经全基因组扩增后,能够进行DNA分型.结论全基因组扩增可以用于LCN的DNA分析,帮助提高微量物证的检出成功率.
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全基因组扩增技术的法医学应用价值及其结果评价
微量模板DNA的分析,一直是法医学特别关注和急需解决的难题之一,近年发展起来的一系列技术为解决这一问题提供了新的可能途径,本文即对微量模板DNA分析技术的进展和目前逐步发展的全基因组扩增技术的法医学应用价值、结果评价进行浅议.
