首页 > 文献资料
-
NR4A1对小鼠卵巢颗粒细胞脂肪代谢相关调控因子的调节作用
目的 观察NR4A1对小鼠卵巢颗粒细胞中脂肪代谢相关调控因子脂联素受体2(Adipo-R2)、解偶联蛋白2(UCP2)、B类清道夫受体(CD36)的调节作用.方法 分别构建NR4A1超表达腺病毒载体(AdCMV-NR4A1)及干涉腺病毒载体(AdH1-siRNA/NR4A1).体外培养小鼠卵巢颗粒细胞,贴壁生长至90%时,分为病毒感染组、胰岛素(100nmol/L)与胰岛素增敏剂(10 2mol/L)组和病毒+胰岛素组.Trizol裂解细胞提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测颗粒细胞中Adipo-R2,UCP2,CD36的mRNA表达水平.结果 在小鼠卵巢颗粒细胞中超表达NR4A1能够促进Adipo-R2,UCP2,CD36基因的转录(P＜0.05),RNA干扰NR4A1后则可以抑制以上基因的表达(P＜0.05);胰岛素可以促进UCP2,CD36基因的表达(P＜0.05),而对Adipo-R2的作用不明显;另外胰岛素增敏剂曲格列酮也能够促进Adipo-R2,UCP2,CD36的表达(P＜0.05);RNA干扰NR4A1 24 h后,再向细胞中加入生理剂量(100nmol/L)胰岛素30 min后Adipo-R2,UCP2,CD36的表达水平与单独干涉组比均可逆转升高(P＜0.05),其中UCP2的表达水平可升高到胰岛素组同样的水平,但Adipo-R2,CD36的逆转升高水平并没有达到仅加入胰岛素时的升高水平(P＜0.05).结论 NR4A1对Adipo-R2,UCP2,CD36具有正向调节作用,同时与胰岛素或胰岛素增敏剂可能有协同调节作用,进而发挥对脂肪代谢的调控.
-
核受体NR4A1功能及调控的研究进展
核受体 NR4A1是核受体 NR4A家族中的重要一员，可通过对靶细胞基因转录的调节，参与细胞的增殖、凋亡调控，在肿瘤发生、血管重塑以及类固醇合成等重要生命活动过程中发挥重要作用，其功能受到磷酸化、蛋白质相互作用等多种途径的调控。本文就有关NR4A1的生物学功能及其调控机理的研究进展作一综述。
-
孤儿核受体N R4A1与动脉粥样硬化的研究进展
孤儿核受体NR4A1是尚未发现特异性配体的转录因子之一，属于NR4A亚家族。早期研究发现，NR4A1可通过改变基因表达、翻译后修饰以及辅调蛋白间相互作用，调控细胞的增殖、凋亡、分化和应激反应。近年来研究发现其在动脉粥样硬化损伤部位表达异常，被认为是血管细胞功能紊乱过程中的关键调节基因。通过调控NR4A1基因的表达，可对平滑肌细胞的增殖和内皮细胞的激活产生重要影响，同时能够减少炎症反应、减少泡沫细胞的形成以及脂质沉积，抑制血管重塑，预防和阻止动脉粥样硬化的发生与发展。这些研究显示NR4A1可能成为研发预防和治疗动脉粥样硬化药物的新靶点。
-
NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建
目的:克隆小鼠孤儿核受体(NR4A1)基因全长cDNA的读码框,构建携带NR4A1基因的重组真核表达载体,为研究其在心肌细胞中的功能做准备.方法:从Pax-8敲除的小鼠心肌组织中提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,利用逆转录PCR法扩增,将目的产物与pGEM-T Easy载体连接,测序分析正确后,再以相同PCR方法扩增,将其与真核表达载体pIERS2-ZsGreenl连接,构建重组质粒.经限制性酶切及测序鉴定后,利用Lipofectamine2000将重组载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1转染到H9C2心肌细胞.实验分三组:①实验组(PZ-NR4A1组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl-NR4A1重组载体；②阴性对照组(NC组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl空载体；③空白对照组(BC组):给予的常规培养液,未做其他处理.并用RT-PCR法和Western blotting法检测转染后NR4A1 mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表达载体.转染重组载体到细胞后,相比BC组(1.00±0.00)和NC组(0.99±0.16),PZ-NR4A1组(2.62±0.21) NR4A1 mRNA表达水平明显升高(P＜ 0.05),而BC组和NC组mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞ 0.05).PZ-NR4A1组(0.72±0.11)NR4A1蛋白的表达量与BC组(0.17±0.07)和NC组(0.21±0.08)相比,PZ-NR4A1组蛋白表达量明显升高(P＜0.05),而BC组和NC组蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:通过基因重组技术,成功克隆了NR4A1基因,并构建了真核表达载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1,且能够在H9C2心肌细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨NR4A1基因的生物学功能及机制奠定了基础.
-
Pax-8基因敲除小鼠心脏中NR4A1基因表达上调
目的:寻找先天性心脏病室间隔缺损相关基因--转录因子Pax-8保护细胞凋亡的途径.方法:提取Pax-8基因敲除小鼠纯合子(Pax-8 KO-/-)和杂合子(Pax-8 KO+/-)的心脏总RNA,利用小鼠基因的基因芯片检测两组小鼠基因表达水平,找出差异表达的基因,并经半定量RT-PCR和荧光实时定量PCR技术初步筛选出转录因子Pax-8的下游基因.结果:基因芯片检测发现,与Pax-8 KO+/-组相比,在Pax-8 KO-/-小鼠中有25个基因表达下调,17个基因表达上调.用半定量RT-PCR验证发现,nuclear receptor sub-family4,group A,member 1(NR4A1)基因在Pax-8 KO-/-组上调.定量RT-PCR亦证实在Pax-8 KO-/-组NR4A1基因的表达水平较Pax-8 KO+/-组及Pax-8+/+(野生型)组分别上调1.53倍和4.79倍(P＜0.01).结论:NR4A1基因受Pax-8基因调控,在Pax-8保护细胞凋亡途径中发挥作用.
关键词： NR4A1 室间隔缺损 细胞凋亡 paired box gene 8 小鼠 -
NR4A1 DNA结合域的表达纯化
目的:寻求一种核受体家族蛋白NR4A1 DNA结合域(NR4A1 DNA binding domain,NR4A1-DBD)表达纯化的方法.方法:构建融合蛋白PET28a-NR4A1-DBD表达载体,分别通过镍亲和层析、阳离子交换层析及凝胶过滤的方法对目的蛋白进行纯化.结果:PET28a-NR4A1-DBD蛋白在低温诱导(24℃)时多以可溶性形式存在,通过此纯化,可达到每升培养基产生2～3 mg蛋白,纯度高达95％以上.结论:镍亲和层析是一种可靠、实用的蛋白表达纯化方法,后续使用阳离子交换层析及凝胶过滤可以进一步提高蛋白纯度.
-
孤儿核受体NR4A1在2型糖尿病患者外周血单个核细胞的表达及意义
目的 探讨孤儿核受体NR4A1在2型糖尿病(T2DM)患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达及意义.方法 选取就诊的34例健康受试者和30例初诊T2DM患者,进行体格检查,包括身高、体重、血压,计算体质指数(BMI);实验室检查:空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(Fins)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、超敏C反应蛋白(hs-CRP),计算HOMA-IR.采集外周血2~3 mL,收集血浆,用于检测游离脂肪酸(FFAs)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6),并采用密度梯度离心法获取PBMCs,real-time PCR检测NR4A1 mRNA在健康人群和初诊T2DM患者PBMCs中分布情况,并对NR4A1 mRNA相对表达水平和HOMA-IR、FFAs、TNF-α、IL-6进行相关性分析.结果 两组人群在年龄、性别、身高、血压、血丙氨酸氨基转移酶、血尿素氮、血肌酐方面,差异无统计学意义(P>0.05);与健康受试者比较,初诊T2DM患者的PBMCs的NR4A1 mRNA相对表达水平增高,此外T2DM患者的BMI、FBG、Fins、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、hs-CRP、FFAs、TNF-α和IL-6水平亦明显增高,血HDL-C水平则降低;T2DM患者的外周血白细胞计数及其分类计数与健康受试者差异无统计学意义(P>0.05);Pearson′s相关分析显示,NR4A1 mR-NA相对表达水平与HOMA-IR(r=0.761,P<0.01)、FFAs(r=0.560,P<0.01)、TNF-α(r=0.697,P<0.01)和IL-6(r=0.796,P<0.01)均呈正相关.同时,评价胰岛素抵抗程度的HOMA-IR也与FFAs(r=0.513,P<0.01)、TNF-α(r=0.728,P<0.01)和IL-6(r=0.590,P<0.01)呈正相关.此外,显著正相关也存在于FFAs和TNF-α(r=0.475,P<0.01)、IL-6(r=0.402,P<0.01)之间.结论 NR4A1在初诊T2DM患者PBMCs中表达增高,且与HOMA-IR、FFAs、TNF-α、和IL-6均呈正相关关系.
-
促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1相互作用的筛选和鉴定
目的 利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白.方法 ①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物,利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段,构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO.②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Western blot检测融合蛋白在酵母中的正确表达,自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度.③对成人肝cDNA文库的筛选.选择能同时激活His、Ura、LacZ 3个报告基因的克隆为阳性,利用回转实验和GST-pull down对阳性克隆进行鉴定.结果 成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体,转化酵母细胞MaV203,无细胞毒性,无自激活作用,3AT浓度为25 mmol/L.经回转实验和GST-pull down证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用.结论 Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控.
关键词： Smac/DIABLO NR4A1 酵母双杂交 -
SLE患者外周血单个核细胞Nr4a1基因的mRNA表达水平
目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)Nr4a1基因mRNA表达水平.方法 通过Ficoll梯度离心法分离出47例SLE患者和30例健康人PBMCs,用TRIzol提取总RNA,再将总RNA逆转录成cDNA,以荧光定量PCR法检测Nr4a1基因mRNA水平,比较SLE患者组和健康对照组的Nr4a1基因mRNA水平差别,分析SLE患者Nr4a1基因mRNA水平与补体C3、补体C4、SLE疾病活动度指数(SLEDAI)的相关关系.结果 与健康对照组比较,SLE患者组PBMCs中Nr4a1基因mRNA水平明显降低,差异有统计学意义.结论 SLE患者PBMCs中Nr4a1基因mRNA水平显著低于健康人.
-
人NR4A1基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建
目的:克隆人NR4A1基因,构建其重组腺病毒载体.方法:用RT-PCR的方法从人卵巢组织中扩增NR4A1基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdtrack-NR4A1.Pme Ⅰ酶切pAdtrack-NR4A1,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组.Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒AdCMV-NR4A1后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增.通过GFP报告基因观察重组病毒的产生.PCR、Western blot检测NR4A1基因的表达.结果:用RT-PCR方法,从人卵巢组织中扩增出1 797 bp的cDNA,测序证实为人NR4A1基因.构建了NR4A1基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒.结论:成功地克隆了人NR4A1基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究NR4A1基因在相关疾病中的作用奠定了基础.
-
血管紧张素II-CaMK-CREB-CYP11B2和肾上腺素-PKA-CREB-CYP11B2途径在应激性高血压发病中的研究
目的 探讨血管紧张素II-CaMK-CREB-CYP11B2和肾上腺素-PKA-CREB-CYP11B2途径在应激性高血压(SIH)发病中的作用.方法 选取鼠龄在6～8 w的SPF级雄性Wistar大鼠28只,适应性喂养7 d后,按照完全随机法分为SIH模型组与正常组,每组14只.通过每天声光间断足底电、夹尾持续刺激12 w构建SIH大鼠模型.采用放射免疫法检测SIH模型大鼠血浆血管紧张素II含量,酶联免疫吸附(ELISA)方法检测SIH模型大鼠血清肾上腺素含量,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学方法检测SIH模型大鼠肾上腺组织Creb、Nr 4a 1、Nr 4a 2、Cyp 11b 2基因mRNA表达和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平及醛固酮合酶(CYP11B2)蛋白表达水平的变化.结果 与正常组比较,SIH模型组大鼠体质量增长明显缓慢,收缩压与舒张压均明显升高(P<0.05),血浆血管紧张素II含量无明显变化(P>0.05),血清肾上腺素含量明显升高(P<0.05),肾上腺组织Creb基因mRNA表达水平明显上调(P<0.05),Nr 4a 1与Nr 4a 2基因mRNA表达水平有下调趋势(P>0.05),Cyp 11b 2基因mRNA表达水平明显上调(P<0.05);与正常组比较,SIH模型组大鼠肾上腺CREB磷酸化水平及CYP11B2蛋白表达水平明显上调(P<0.05).结论 SIH模型组大鼠肾上腺组织肾上腺素-PKA-CREB-CYP11B2途径的激活是血液醛固酮含量增多、应激性高血压发病的原因之一.
