重组大肠杆菌BL21-pET28a(+)-ADH诱导表达羰基还原酶的条件优化与应用
摘要： 目的:对重组大肠杆菌E.coli BL21-pET28a(+)-ADH表达羰基还原酶的条件进行优化,以增加目的蛋白的表达量,提高生物合成(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的转化率.方法:将重组质粒pET28a(+)-ADH转化E.coli BL21后,对诱导过程产生影响的4个因素,诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌转数,利用SPSS统计学软件进行正交实验设计,并对实验结果进行直观分析及方差分析,对实验得出的佳搭配诱导条件进行验证.结果:直观分析中诱导温度的R值大,其次为摇菌转数和诱导剂IPTG浓度,诱导时间的R值小;方差分析表明诱导温度的P值小于0.05,而摇菌转数、IPTG浓度及时间因素的P值均大于0.05.利用优化后的菌种生物合成(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇,转化率达到95.16%.结论:本实验的优诱导条件为,诱导温度25℃、诱导摇菌转数200r·min-1、诱导剂IPTG浓度0.5mmol·L-1、诱导时间6h.且重组菌对于(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的转化率达到95.16%.
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超高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中依非韦伦的浓度
目的:建立超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS)定量测定人血浆中依非韦伦的浓度.方法:使用蛋白沉淀法处理血浆,以依非韦伦-D5为内标,色谱柱:Phenomenex Gemini C18(2 mm×100 mm,5μm,110 A);柱温:40℃;流动相:乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵(80:20),等度洗脱;流速:0.25 mL·min-1.负离子(ESI-)扫描模式,多反应监测方式(MRM)测定该药浓度.考察该方法的专属性、准确度与精密度、提取回收率与基质效应、全血稳定性及稀释可靠性等.结果:血浆样品中依非韦伦回归方程为Y=0.494x+8.32×10-6(r=0.9991),表明依非韦伦在0.1～8μg·mL-1线性关系良好,定量下限为0.1μg·mL-1.批内、批间精密度的RSD均<15％,待测物及内标平均回收率>95％且总体相等标准偏差(RSD)<15％,稳定性良好.结论:该方法简便灵敏、准确可靠,适用于人体血浆中依非韦伦浓度的测定.
关键词： 超高效液相色谱串联质谱法 依非韦伦 血药浓度 药代动力学 -
肥胖危重患者美罗培南PK/PD的对照研究
目的:对比重症监护室(ICU)中的肥胖患者与非肥胖患者美罗培南的PK/PD达标率,评估肥胖重症患者美罗培南剂量是否需要调整.方法:回顾性分析2017年1月～12月ICU应用美罗培南的患者,分为肥胖组(体质指数≥28 kg·m-2)38人,对照组(18.5 kg·m-2≤体质指数<24 kg·m-2)37人.两组患者美罗培南的初始剂量都为1 g q8h,静滴3 h,之后根据肌酐清除率进行剂量调整.在第二天给药前(T0)和静滴结束后(T3)抽血,以HPLC法进行美罗培南血清药物浓度的测定,将两个时间点的浓度值运用一室模型获得药动学参数.将100％T>4MIC即Cmin/MIC>4作为靶目标,得出敏感MIC值时肥胖组和对照组PK/PD的达标率,并对达标率的影响因素进行回归分析.结果:所有75名患者美罗培南的谷浓度变异系数达到75％,两组美罗培南药动学参数没有显著性差异.肥胖组和对照组按敏感MIC值计算PK/PD达标率分别为78.6％和81.5％,没有统计学差异.达标率影响因素的回归分析显示,年龄、性别、肾功能、APACHEⅡ评分均不构成危险因素,只与是否接受连续性肾脏替代治疗(Continuous renal replacement therapy,CRRT)显著相关,P值为0.003.在亚组分析中,肥胖组和对照组中进行CRRT的患者美罗培南血清谷浓度没有显著性差异,但在没有接受CRRT治疗的患者中,肥胖组的PK/PD达标率为73.7％.而对照组为100％,P=0.009.结论:肥胖重症患者的美罗培南药动学参数没有发生显著性改变,PK/PD达标率与对照组相当.值得注意的是,不进行CRRT治疗的肥胖患者美罗培南PK/PD达标率较低,其药动学参数Vd和CL显著高于对照组,需要调整给药方案.
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柱前手性衍生化-反相高效液相色谱法拆分布洛芬对映异构体
目的:建立一种柱前手性衍生化-反相高效液相色谱紫外法检测布洛芬的异构体.方法:以N′N-羰基二咪唑(CDI)作为活化剂活化布洛芬的羧基基团,再以(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(R-NEA)作为手性衍生化试剂进行反应.选用Kromasil C18色谱柱,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,以乙腈-0.05％磷酸(68:32)为流动相,检测波长225 nm.结果:布洛芬的非对映异构体色谱峰的保留时间分别为25.6 min和27.9 min.结论:本方法操作简单,条件温和,衍生化产物稳定,且衍生化试剂价格便宜,更准确地实现了对布洛芬对映异构体的分离检测.
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ICP-MS法测定含牛黄、石膏中成药内27种元素的含量
目的:了解含牛黄、石膏中成药中微量和痕量元素的含量情况,为相关标准制定提供数据支持.方法:供试品经过硝酸消解后,采用ICP-MS法测定10批中成药中27种微量和痕量元素的含量.结果:在两批含有牛黄和石膏的中成药中,As或Hg含量较高,超过《中国药典》对有关品种规定的限度值.结论:某些含石膏和牛黄的中成药应用广泛,作为常用药,为了保证用药的安全,有必要检测其重金属等有害元素的含量.
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磷酸肌酸钠对创伤性脑心综合征患者心脏局部室壁运动异常和射血分数值的影响
目的:观察磷酸肌酸钠(creatine phosphate sodium,CP)对创伤性脑心综合征患者心脏局部室壁运动异常、射血分数值、心肌酶及血浆脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)的影响.方法:选择创伤性脑损伤患者45例,年龄18～65岁,均行手术治疗后入ICU,随机数字表法分为对照组(C组)22例和治疗组(CP组)23例.C组进行常规治疗.CP组在接受常规治疗基础上,加用磷酸肌酸钠治疗:1.0 g/次,2次/d,静脉滴注3 d.分别于治疗前、治疗后3 d由同一位医师行床旁超声心动图检查,测定左室射血分数(LVEF)和局部室壁运动异常值(RWMA),同时抽取患者静脉血测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)以及血浆脑钠肽(BNP)的水平.结果:治疗后超声心动图检查提示,CP组室壁运动较C组明显改善.CP组心肌酶和BNP水平较C组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论:磷酸肌酸钠能减轻心脏局部室壁运动障碍,改善心肌收缩力,降低创伤性脑损伤患者心肌酶和血浆BNP水平,对防治脑心综合征有益.
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白花蛇舌草水提物通过抑制MAPK通路致肺癌细胞的凋亡
目的:研究白花蛇舌草(BHSSC)水提物对肺癌细胞增殖、凋亡的影响以及体内抑制肿瘤活性,进一步通过研究其对凋亡关键通路MAPK信号通路的影响,以阐明白花蛇舌草抗肺癌分子机制.方法:制备BHSSC水提取物,采用MTT法研究其对人肺癌细胞株A549和PC-9细胞体外增殖的抑制活性,并进一步构建人肺癌的裸鼠移植瘤模型,研究BHSSC水提物的体内抗肿瘤活性;通过Western blot技术研究BHSSC水提取物对MAPK通路中关键蛋白Erk、JNK、p38的表达水平和磷酸化水平的影响,进而阐明白花蛇舌草诱导肺癌细胞凋亡机制.结果:BHSSC水提取物可以剂量依赖性地促进肺癌细胞的凋亡,从而抑制肺癌细胞的增殖.当剂量达到600μg·mL-1时,肺癌细胞抑制率达到95％(P<0.01).荷瘤裸鼠模型结果显示,在给药21天后,给药组与肺癌模型组相比,肿瘤体积显著减小,平均抑瘤率达到70％(P<0.01).Western blot结果提示,BHSSC水提物能够显著抑制MAPK通路中关键蛋白p38、Erk、JNK的磷酸化水平.结论:BHSSC水提物能够通过抑制肺癌细胞MAPK通路的活化,促进肺癌细胞凋亡,从而抑制肺癌的体内体外增殖.
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靶向前列腺癌的纳米超声造影剂的研究
目的:对前期研究的适体修饰的多壁碳纳米管(MWCNTs)纳米靶向造影剂作进一步的研究探讨.方法:对纳米超声造影剂采用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪进行体外细胞摄取评价.采用裸鼠移植瘤模型对造影剂进行体内靶向性评价、体内显影效果与代谢分布评价.结果:体外细胞学研究表明,该造影剂可被细胞摄取,且分布于细胞质中.体内靶向性评价结果表明,该造影剂具有肿瘤靶向性,且其在体内显影效果较好.结论:该新型造影剂能够靶向显影肿瘤部位,具有良好地临床应用的潜能.
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炎琥宁生产母液中原料回收实验研究
炎琥宁生产过程中会产生大量含炎琥宁产品的母液,对炎琥宁结晶母液进行减压浓缩、冷冻干燥、酸化、重结晶处理,将母液中的炎琥宁转化为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯进行回收.经分析检测,从结晶母液中回收的脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的纯度为89.04％,可以作为生产炎琥宁的原料循环回用.本工艺在提高产品总收率和降低原料成本方面合理可行,具有工业参考价值.
关键词： 结晶母液 回收 炎琥宁 脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯 -
肌动蛋白2基因(ACTG2)对肝癌肿瘤细胞侵袭转移促进作用的实验研究
目的:明确平滑肌肠道肌动蛋白ACTG2在肝癌细胞(HCC)侵袭转移过程中的作用,为治疗HCC转移提供有希望的治疗靶标.方法:通过病毒逆转录载体沉默ACTG2即制备shACTG2,通过Western Blot、免疫荧光、PCR实验验证ACTG2被成功干扰,接着以体外划痕实验、Transwell实验,考察Control组、Scramble组及shACTG2组肝癌细胞侵袭与转移与ACTG2表达的相关性;qRT-PCR用来扩增ACTG2mRNA,采用Western Blot验证ACTG2-OE高表达模型成功建立后,通过体内裸鼠实验性转移模型,在尾静脉注射HepG2细胞、ACTG2-OE、ACTG2 shRNA质粒转染的SMMC-7721细胞,考察裸鼠体内肝癌转移至肺的节结数.结果:shACTG2组无论在划痕实验还是Transwell实验都显示出较低侵袭转移的倾向,并且与HepG2对照组相比具有显著性差异,体内实验结果也显示肺结节转移数shACTG2组少,与对照组及ACTG2-OE高表达组比较均具有显著性差异.结论:ACTG2在HCC细胞侵袭转移中具有促进作用.
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复方苦参注射液联合盐酸吗啡缓释片治疗中重度癌痛的临床疗效研究
目的:研究复方苦参注射液联合盐酸吗啡缓释片治疗中、重度癌痛的临床疗效.方法:设对照组和治疗组,每组30例,对照组予以盐酸吗啡缓释片,治疗组予以盐酸吗啡缓释片联合复方苦参注射液.观察两组患者疼痛缓解率、不良反应以及生活质量改善情况.结果:两组患者疼痛缓解总有效率比较具有统计学差异(P<0.05);治疗组疼痛完全缓解和中度缓解优于对照组,具有统计学意义(Z=-1.996);治疗组便秘反应发生率明显低于对照组(χ2=4.812,P=0.028).结论:复方苦参注射液具有协同镇痛、缓解便秘和改善患者生活质量的作用.
