毛菊苣单体化合物及配伍组降脂相互作用研究
摘要： 目的:考察毛菊苣单体3个化合物之间是否存在配伍协同作用,在可能的情况下,寻找优配比.方法:对单体化合物采用3个简单配伍组合,以HepG2细胞内脂滴为指标,考察配伍组是否有显著性降脂作用以及是否某个化合物起着更为重要的作用;运用均匀设计方法,使得配伍组合在一定空间内均匀分布,设计9组配伍组,再次科学地考察配伍组的降脂作用,寻找可能的佳组合;采用SAS软件对12组配伍结果进行拟合算法分析,考察各个单体之间是否存在交互作用.结果:单体化合物3个简单配伍组及9个均匀配伍组均能显著地降低HepG2细胞高脂模型中脂滴的含量,但3个单体之间没有发现明显的交互作用.结论:毛菊苣单体化合物及配伍组可显著地降低HepG2细胞高脂模型中脂滴的含量,但单体之间没有发现明显的交互作用.
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樟芝多糖抑制肿瘤相关成纤维细胞生成的作用研究
目的:研究樟芝多糖抑制肝癌细胞条件性培养基诱导骨髓间充质干细胞(MSC)向肿瘤相关成纤维细胞转化的作用.方法:分离人肝癌细胞HepG2培养基(CM),将骨髓间充质干细胞分为正常组、对照组和实验组,正常组为常规DMEM培养基+10％胎牛血清(FBS),对照组为CM+10％FBS培养,实验组为CM+10％FBS培养+10 mg/L的樟芝多糖培养.应用CCK-8试剂盒检测MSC的细胞活性,BrdU标记-流式细胞术检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,PI染色检测细胞周期变化,Western blot法检测α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)、肌间线蛋白(Desmin)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、凝血酶敏感蛋白1(Tsp-1)、成纤维细胞特异蛋白(FSP)的表达以及转化生长因子 β1(TGF-β1)、信号转导分子(Smad1、Smad2)的表达水平,免疫荧光染色法检测 α-SMA、FAP和FSP的表达水平.结果:对照组MSC的细胞活力显著高于正常组和实验组(P<0.05),三组细胞的细胞凋亡率无统计学差异(P>0.05),对照组MSC中G0/G1期比例降低,S期比例增高,相比正常组和实验组具有统计学差异(P<0.05),对照组MSC中α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP的表达水平以及TGF-β1、Smad1、Smad2的表达水平显著高于正常组和实验组(P<0.05),免疫荧光结果也显示对照组中α-SMA、FAP和FSP的水平显著高于正常组和实验组(P<0.05).结论:肝癌细胞条件性培养基可以促进MSC向肿瘤相关成纤维细胞转化,而樟芝多糖可以抑制该转化,这是樟芝多糖抗肿瘤作用的机制之一.
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黄连解毒汤对幼龄自发性高血压大鼠血管内皮NO通路影响的研究
目的:研究黄连解毒汤(HLJD)对自发性高血压大鼠(SHR)血管内皮保护作用及该药物的作用机制.方法:40只6周龄雄性SHR大鼠随机分为模型组(SHR组)、阳性组(卡托普利组)、黄连解毒汤高剂量组、黄连解毒汤低剂量组每组10只,空白组10只(正常WKY大鼠),灌胃6周并用无创尾套法测量其尾动脉收缩压及舒张压;酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清中一氧化氮(NO)、超氧物歧化酶(SOD)、血管紧张素II(An-gII)、钙调素(CaM)含量变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹技术(Western blot)测定胸主动脉中Ras同源基因家族成员A(RhoA)、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶(cGK)、肌球蛋白结合亚单位(MYPT1)mRNA与蛋白表达情况.结果:给药6周后,与模型组相比,黄连解毒汤各剂量组和阳性组均能显著地降低大鼠的血压.与空白组比较,模型组动物血清中AngII与SOD水平显著升高(P<0.01),NO与CaM水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,阳性组和黄连解毒汤各组中的AngII与SOD水平降低(P<0.01或P<0.05),NO与CaM水平提高(P<0.01或P<0.05).黄连解毒汤能够降低高血压大鼠胸主动脉RhoA、MYPT1的表达(P<0.05),并能提高高血压大鼠胸主动脉cGK的表达(P<0.05).结论:黄连解毒汤能降低高血压大鼠的血压,调节血管内皮舒缩因子的分泌,并可影响cGK,RhoA,MYPT1等因子的表达,而这些因子的表达与NO的活性密切相关.
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云南白药通过抗炎作用缓解碘乙酸钠诱导的大鼠膝骨关节炎疼痛
目的:研究云南白药对碘乙酸钠(sodium iodoacetate,MIA)诱导的大鼠膝骨关节炎疼痛改善机制.方法:选取健康SD雄性大鼠,随机分为4组,每组10只,分别为正常组(B)、模型组(C)、云南白药组(YB,125 mg/kg)和双氯芬酸钠组(Diclofenac sodium,DF,2.5 mg/kg).除正常组外,每只鼠右后膝关节注射2 mg MIA.造模前1 d,测每只鼠右后肢的机械痛阈值及冷痛潜伏期作为各指标的基础值.造模后给药组按剂量灌胃给药,并每周测两次机械痛及冷痛潜伏期.药物治疗35 d后测定大鼠血清PGE2水平,行膝骨关节HE染色,参照Markin评分标准评价治疗效果.将数据进行统计学分析.结果:与空白组相比,模型组大鼠膝骨关节炎机械痛阈值显著降低(P<0.01),血清PGE2水平增高(P<0.01).与模型组相比,云南白药和双氯芬酸钠能显著提高大鼠膝骨关节炎机械痛阈值(P<0.01),降低膝骨关节炎大鼠血清PGE2水平(P<0.05),延缓膝骨关节炎软骨损伤.结论:云南白药可能通过抗炎作用显著缓解MIA诱导的大鼠膝骨关节炎疼痛症状.
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左卡尼汀对大鼠糖尿病肾病的保护作用分析
目的:探讨与分析左卡尼汀对大鼠糖尿病肾病的保护作用.方法:24只8周龄的雄性SD大鼠随机分为3组,每组8只大鼠.为对照组提供单次腹腔内生理盐水(10 mL/kg)注射,接着静脉注射生理盐水(1 mL/kg);为糖尿病肾病组提供单次腹腔内链脲霉素(65 mg/kg)注射,接着静脉注射生理盐水(1 mL/kg);对于实验组,则提供单次腹腔内链脲霉素(65 mg/kg)注射,接着静脉注射左卡尼汀(50 mg/kg),都为1次/d,持续14 d,记录实验后肾功能情况.结果:实验组与糖尿病肾病组都造模成功,实验后实验组与对照组的体质量显著高于糖尿病肾病组(P<0.05),血肌酐与尿蛋白排泄量及IL-6、TNF-α含量都显著低于糖尿病肾病组,肾组织Bcl-2、Caspase-3表达量都显著低于糖尿病肾病组,实验组与对照组之间对比差异无统计学意义(P>0.05).结论:左卡尼汀在大鼠糖尿病肾病中的应用能有效发挥肾功能保护作用,抑制肾组织的Bcl-2、Caspase-3表达,促进大鼠体质量恢复正常.
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基于GEO数据库筛查急性淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药相关基因
目的:基于全基因组表达芯片筛查急性淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药相关的基因,分析其可能参与的信号传导通路.方法:从GEO数据库中下载表达谱数据集,应用R软件分析急性淋巴细胞白血病糖皮质激素敏感组与耐药组差异表达基因(DEGs),并对差异基因进行基因功能(GO)分析和信号通路富集分析,构建基因间相互作用网络,筛选出关键基因.结果:共筛选出差异基因109个,其中表达上调基因86个,下调基因23个.GO富集分析得到DEGs主要涉及免疫应答,凝血调节,细胞增殖和凋亡、细胞迁移等生物过程;pathway分析发现DEGs主要富集参与MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB-MAP通路、细胞凋亡等;互作网络分析挖掘出的关键基因FOS、NFKB1、MAP2 K1、IRS1、CASP3.结论:糖皮质激素耐药的急性淋巴细胞白血病存在基因差异表达,筛选出耐药相关的重要作用基因及信号通路.
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自噬在肾间质纤维化小鼠中的表达趋势
目的:观察肾间质纤维化单侧输尿管梗阻模型(UUO)术后不同时间点自噬的表达趋势.方法:32只清洁级健康雄性ICR小鼠随机分组:假手术(Sham)组、UUO模型(UUO)组,分别在UUO术后3、7、14 d处死小鼠,假手术组7 d处死,每组小鼠8只.留取血清检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),肾组织行HE和Masson染色,观察光镜病理结果,电镜超微结构观察自噬体的形成,Westernblot检测肾组织LC3蛋白和P62蛋白的表达.结果:UUO术后梗阻侧肾脏皮质变薄,小管萎缩,间质纤维化,单个核细胞浸润,肾小球无明显病变,病理变化以UUO术后14 d突出.与Sham组相比,LC3-Ⅱ蛋白含量从3 d开始逐渐增高,7 d时达峰值,14 d时下降;而P62与LC3-Ⅱ相反,3 d开始下降,7 d达低值,14 d又逐渐恢复,表明自噬在7d这个时间点表达显著.电镜显示UUO术后7 d出现自噬小体和吞噬泡现象.结论:UUO术后自噬的表达有一定的时间依赖性,在7d时表达显著,自噬与病理严重程度不平行.
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HBV感染者外周血T淋巴细胞表面共刺激分子和T淋巴细胞亚群的检测及临床意义
目的:探讨HBV感染者外周血T淋巴细胞表面共刺激分子和T淋巴细胞亚群与HBV-DNA的关系及在HBV感染发展中尤其是重症化进程(如慢加急性肝功能衰竭)的作用.方法:选取浙江大学医学院附属第一医院及浙江省青春医院收治的120例慢性HBV感染者,其中慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者60例,乙肝肝硬化(LC)患者30例,慢加急性肝功能衰竭(ACLF)患者30例.CHB组又分为HBeAg阳性组30例,HBeAg阴性组30例.以同期30例健康体检者为对照组.采用流式细胞术检测各组外周血CD4+和CD8+T细胞表面程序性死亡因子(PD-1),细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4),T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim3),T淋巴细胞(CD3+),辅助T细胞(CD4+)和抑制T细胞(CD8+)百分比,PCR法检测各组HBV-DNA载量.采用Pearson分析相关性.结果:HBV感染者CD4+CTLA-4和CD8+CTLA-4的表达均低于对照组,其中CHB组CD4+CTLA-4、CD8+CTLA-4、CD8+PD1、CD4+Tim3和CD8+Tim3的表达均高于LC组和ACLF组,差异均具有统计学意义(P<0.05).HBV感染者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表达均低于对照组,CD8+的表达高于对照组,CHB组CD3+,CD4+和CD4+/CD8+均高于LC组和ACLF组,CD8+的表达均低于LC组和ACLF组,CHB组HBV-DNA水平高于LC组和ACLF组,差异均具有统计学意义(P<0.05).CHB组中HBeAg阳性组CD4+CTLA-4、CD8+CTLA-4、CD3+、CD4+和CD4+/CD8+的表达均低于HBeAg阴性组,CD4+PD1、CD8+PD1、CD4+Tim3、CD8+Tim3和CD8+的表达均高于HBeAg阴性组(P<0.05).HBV感染者HBV-DNA与CD8+PD-1,CD8+Tim3存在显著正相关性(P<0.05),与CD4+CTLA-4,CD8+CTLA-4,CD4+Tim3,CD4+PD-1,CD3+,CD4+和CD8+不具有相关性(P>0.05).与LC组比较,ACLF组患者CD4+PD-1的表达水平升高,CD8+CTLA-4的表达水平降低.结论:外周血T淋巴细胞表面共刺激分子和T淋巴细胞亚群比例与HBV感染发展尤其是重症化进展(如ACLF)相关联,对疾病的疗效和预后判断具有一定的临床应用价值.
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益气养阴生肌方对复发性口腔溃疡大鼠的治疗作用及其对黏膜炎症因子和机体免疫功能的影响
目的:分析益气养阴生肌方对复发性口腔溃疡(ROU)大鼠的治疗作用及其对黏膜炎症因子和机体免疫功能的影响.方法:选取SPF级Wistar雄性大鼠60只,随机数字表法将大鼠分成6组,分别为益气养阴生肌方低、中、高剂量组、正常组、模型组及阳性对照组,每组各10只,除正常组外其他各组大鼠制备ROU模型,成功造模后,益气养阴生肌方低、中、高剂量组分别给予0.17mg/kg、0.34 mg/kg、0.68 mg/kg的益气养阴生肌方药液,阳性对照组灌胃布洛芬药液,正常组和模型组灌胃生理盐水,1次/d,连续灌胃10 d.观察各组大鼠溃疡数量、持续、间隔时间及溃疡面积,检测各组大鼠血清白细胞介素-2R (IL-2R)、IL-1β、IL-17、γ-干扰素(IFN-y)、IL-2、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)及T淋巴细胞含量,同时检测溃疡组织内NLRP3 mRNA相对表达量和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2蛋白表达情况.结果:给药后2、6、10 d时阳性对照组、益气养阴生肌方中、高剂量组大鼠溃疡面积低于模型组,益气养阴生肌方中、高剂量组溃疡面积低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);和正常组相比,模型组大鼠血清IL-2R、IL-17、IL-1 β及IFN-γ含量上升,血清IL-2含量下降;和模型组相比,阳性对照组、益气养阴生肌方中、高剂量组大鼠血清IL-2R、IL-17及IFN-γ含量下降,血清IL-2含量上升,差异均有统计学意义(P＜0.05);和正常组相比,模型组大鼠血清TGF-β1、EGF含量下降,血清VEGF含量,溃疡组织内NLRP3mRNA相对表达量及MMP-9、MMP-2蛋白表达量上升;和模型组相比,阳性对照组、益气养阴生肌方中、高剂量组大鼠血清TGF-β1、EGF、VEGF含量上升,溃疡组织内NLRP3 mRNA相对表达量及MMP-9、MMP-2蛋白表达量下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:益气养阴生肌方可纠正ROU大鼠免疫功能紊乱,降低血清炎症因子含量,以起到治疗作用.
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PDCD4增强鼻咽癌细胞系CNE1对顺铂化疗敏感性机制研究
目的:探讨抑癌基因程序性细胞死亡因子4 (the programmed cell death 4,PDCD4)在促进化疗药物顺铂(CDDP)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用及可能的机制.方法:CCK8法检测人鼻咽癌系CNE1细胞转染PDCD4前后对CDDP导致的细胞毒性作用影响;Annexin V/FITC和PI凋亡检测转染PDCD4前后对CDDP诱导凋亡的作用;West-em blot实验初步探讨其可能的分子机制.结果:PDCD4增强CDDP对人鼻咽癌系CNE1细胞的杀伤作用;PDCD4增加CDDP诱导人鼻咽癌系CNE1细胞凋亡率;机制研究发现PDCD4显著降低人鼻咽癌系CNE1细胞中Twist及MDR1蛋白的表达量,从而促进化疗敏感性.结论:PDCD4通过抑制Twist蛋白增强化疗药物敏感性,提示其参与了鼻咽癌化疗治疗进程.
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MicroRNA-136靶向CD163抑制CD68+CD163+M2型巨噬细胞极化的作用研究
目的:研究微小RNA(miR-136)通过靶向CD163抑制CD68+M0巨噬细胞向CD68+CD163+ M2巨噬细胞极化的作用机制.方法:采用流式细胞术检测20例肝细胞肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织中CD68+ CD163+ M2巨噬细胞的比例,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肿瘤及癌旁组织中miR-136的水平.分离人脾脏中CD68+ M0巨噬细胞,将细胞分为对照组(Control),miRNA模拟物组(miRNA mimic)和miRNA抑制物组(miRNA inhibitor).IL-4和IL-13 10ng/mL诱导巨噬细胞M2型极化.采用流式细胞术检测CD68+ CD163+ M2巨噬细胞比例,Western blot检测细胞中CD163、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达以及M2巨噬细胞标志物精氨酸酶(Arg1)的表达,机制研究中检测JAK/STAT信号中蛋白酪氨酸激酶1(JAK1)、信号转导子与转录激活子1(STAT1)和STAT6的水平,PI3K/AKT信号中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)的表达.荧光素酶报告基因法确定miR-136与CD163的靶向关系.结果:肝癌组织中M2型巨噬细胞比例显著高于癌旁组织,而miR-136的表达显著低于癌旁组织,两者表达具有负相关.荧光素酶报告基因结果显示CD163是miR-136的靶基因.miRNA mimic组中CD68+ CD163+ M2巨噬细胞比例显著低于miRNA inhibitor组,与Control组比较无统计学差异.机制检测中发现miRNA mimic中JAK1、STAT6、PI3K、AKT1低表达,说明miR-136可以间接抑制JAK1-STAT6以及PI3 K-AKT1的表达,抑制M2巨噬细胞极化.结论:miR-136可以靶向CD163抑制M2型巨噬细胞极化,其作用机制与JAK1-STAT6以及PI3 K-AKT1抑制有关,这是M2巨噬细胞在肝癌免疫中的调节机制之一.
