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间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

白亚玲；徐金升；田恬；张俊霞；崔立文；张慧然；张胜雷

关键词：肌细胞平滑肌钙质沉着症碱类

摘要： 目的探讨间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的影响及其机制.方法体外分离培养大鼠VSMC,将传代培养至第4代的细胞按随机数字表法分为正常对照组、高磷+ pH7.4组、高磷+pH7.5组、高磷+pH7.6组和高磷+pH7.7组.正常对照组采用含10％胎牛血清的培养基培养,其他各组采用含10 mmol/L β-甘油磷酸的高磷培养基培养,然后分别加入7.4％ NaHCO3调整pH值为7.4、7.5、7.6和7.7.干预4h后,正常对照组更换正常培养基,其余4组的培养基均更换为高磷基础上pH值为7.4的培养基,然后隔ld更换培养基1次.干预4d后,分别应用RT-PCR和Western blot检测VSMC的L型钙通道(LTCC) β3亚基和Runt相关转录因子2(Runx2) mRAN和蛋白的表达水平;干预4d后,应用钙离子探针Fluo-3/AM检测VSMC内钙离子水平;干预14 d后,应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定碱性磷酸酶(ALP)活性;干预14 d后,通过测量钙含量观察细胞钙化程度.结果 (1)与正常对照组比较,高磷+ pH7.4组LTCC β3亚基mRNA和蛋白表达水平均较高(分别为0.49±0.03比0.23±0.02和0.45±0.03比0.26±0.02,P均＜0.05);与高磷+ pH7.4组比较,高磷+pH7.5组LTCCβ3亚基mRNA(0.86±0.05)和蛋白(0.62±0.04)表达水平均较高(P均＜0.05);与高磷+pH7.5组比较,高磷+pH7.6组LTCC β3亚基mRNA(0.99±0.05)和蛋白(0.80±0.03)表达水平均较高(P均＜0.05);与高磷+pH7.6组比较,高磷+pH7.7组LTCC β3亚基mRNA(1.16 ±0.05)和蛋白(0.93±0.03)表达水平均较高(P均＜0.05).(2)与正常对照组比较,高磷+ pH7.4组细胞内钙离子水平较高(124.61 ±6.06比75.68±7.82,P＜0.05);与高磷+pH7.4组比较,高磷+pH7.5组细胞内钙离子水平较高(210.85±9.75,P＜0.05);与高磷+pH7.5组比较,高磷+pH7.6组细胞内钙离子水平较高(298.44±11.42,P＜0.05);与高磷+pH7.6组比较,高磷+ pH7.7组细胞内钙离子水平较高(401.13±11.41,P＜0.05).(3)与正常对照组比较,高磷+ pH7.4组Runx2 mRNA、蛋白表达水平和ALP活性均较高(分别为0.60±0.04比0.34±0.03、0.42±0.04比0.21 ±0.02、67.2±4.3比23.2±2.3,P均＜0.05);与高磷+pH7.4组比较,高磷+ pH7.5组Runx2 mRNA (0.76±0.05)、蛋白(0.68±0.03)表达水平和ALP活性(102.1±5.4)均较高(P均＜0.05);与高磷+pH7.5组比较,高磷+pH7.6组Runx2 mRNA(0.90±0.05)、蛋白(0.90±0.05)表达水平和ALP活性(139.3±4.9)均较高(P均＜0.05);与高磷+pH7.6组比较,高磷+ pH7.7组Runx2 mRNA(1.11 ±0.05)、蛋白(1.08±0.06)表达水平和ALP活性(197.0±6.7)均较高(P均＜0.05).(4)与正常对照组比较,高磷+pH7.4组钙含量较高[(75.4 ±4.3)mg/g蛋白比(25.2±2.1)mg/g蛋白,P＜0.05];与高磷+pH7.4组比较,高磷+pH7.5组钙含量较高[(100.8±5.7) mg/g蛋白,P＜0.05];与高磷+pH7.5组比较,高磷+pH7.6组钙含量较高[(143.5 ±6.1)mg/g蛋白,P＜0.05];与高磷+pH7.6组比较,高磷+pH7.7组钙含量较高[(205.1 ±8.2) mg/g蛋白,P＜0.05].结论间歇性碱刺激可促进高磷诱导的大鼠VSMC钙化,可能是通过促进LTCC β33亚基表达,增加钙离子内流,从而促使VSMC发生表型转化来实现.

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