Luminex液相芯片技术测定人早孕滋养层细胞及蜕膜细胞中基质金属蛋白酶的表达
摘要： 目的 研究人正常早孕滋养层细胞与蜕膜细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的表达特点,探讨子宫内膜蜕膜化进程中MMPs的变化及对胚胎着床的影响.方法 收集正常妇女分泌期子宫内膜及人正常早孕绒毛和相应蜕膜标本各5例,分别进行离体培养,鉴定其纯度在98%以上后,收集培养上清液,利用Luminex(LumAvidin Beads)测定培养上清液中MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13)蛋白表达的变化,分析MMPs在不同培养条件下的表达差异及表达之间的相关性.结果 ①在不同培养条件下,MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9均有表达,MMP-12及MMP-13分别在ESC及DSC中无表达,且MMP-8、MMP-12、MMP-13表达均低.②与子宫内膜细胞相比,MMP-1、MMP-3、MMP-7在DSC,EVCT中表达均降低,降低有显著性差异(P＜0.05),而MMP-2、MMP-8、MMP-9在DSC,EVCT中则显著升高,升高有显著性差异(P＜0.05).且在蜕膜细胞中,MMP-1、MMP-3、MMP-2、MMP-7高表达尤为显著.③与蜕膜细胞相比,MMP-1、MMP-3、MMP-7在EVCT中表达显著降低(P＜0.05).MMP-2、MMP-9、MMP-13在EVCT中升高有显著性(P＜0.05).且在滋养层细胞中,MMP-2、-9高表达尤为显著.④MMPs之间的相关性:MMP-2与MMP-9相关关系显著(P＜0.05),且关系较密切(r=0.6645).MMP-1,MMP-3,MMP-7两两间相关关系显著(P＜0.05),且关系密切(r＞0.7340).其他MMP之间相关关系不显著.结论 首次利用Luminex xMAP方法多通量的检测到子宫内膜间质细胞、早孕蜕膜细胞与滋养层细胞的多种MMPs的表达,它们均可分泌多种MMP,但是不同种类组织细胞的表达量不同;MMPs可能通过调控子宫内膜蜕膜化及母胎界面间MMPs的变化而影响胚胎着床,为成功妊娠创造条件.
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沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力
目的 探究沉默Yes相关蛋白1(YAP1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法 采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测YAP1在鼻咽癌细胞系中的表达水平;在鼻咽癌细胞S26和S18中转染3条合成的小干扰RNA:si-NC,si-YAP1#1和si-YAP1#2,以转染阴性对照si-NC的细胞作为对照组,转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的细胞作为实验组,实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后的干扰效率;通过细胞计数、平板克隆形成等方法评估转染si-YAP1#1和si-YAP1#2后的实验组和转染si-NC的对照组对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;用划痕和Transwell方法分析各组细胞迁移与侵袭能力的变化;Western blot检测各组细胞中c-myc、上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)等与细胞增殖和上皮间质转化相关蛋白的表达变化.结果 YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达;与阴性对照组相比,转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的实验组细胞中YAP1的mRNA及蛋白水平均显著降低(P<0.05);生长计数、平板克隆、划痕及Transwell等实验结果均显示转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的实验组细胞的生长和克隆能力、划痕愈合能力及侵袭能力较阴性对照组细胞明显下降(P<0.01);且相较阴性对照组,实验组细胞中c-myc、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平降低,E-cadherin的表达量增加.结论 YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达,在鼻咽癌细胞中利用siRNA靶向敲低YAP1的表达后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,提示YAP1可以作为一个潜在的鼻咽癌临床治疗干预靶点.
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肿瘤相关巨噬细胞通过诱导肝癌细胞自噬降低索拉菲尼的促凋亡作用
目的 探讨索拉菲尼治疗肝癌耐药的分子机制,寻找逆转耐药新靶点.方法 体外诱导THP-1细胞建立M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),免疫荧光鉴定M2型TAMs,将SMMC-7721细胞分为空白对照组、M2-TAMs共培养组、索拉菲尼组以及索拉菲尼与M2-TAMs共培养联合处理组,CCK-8法检测M2-TAMs对索拉菲尼抑制SMMC-7721增殖的影响;Annexin V/PI双染法、蛋白质免疫印迹法检测使用自噬抑制剂氯喹处理前后M2-TAMs对索拉菲尼促SMMC-7721细胞增殖、细胞凋亡的影响及细胞凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的表达量变化.结果 索拉菲尼对肝癌细胞SMMC-7721作用48 h的IC50为2.25μmol/L,索拉菲尼对与M2-TAMs共培养(共培养给药组)48 h的SMMC-7721的IC50为4.72μmol/L.共培养给药组与单独给药组相比细胞凋亡率明显下降(P<0.01),Bcl-2表达明显增加,Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05),而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高(P<0.001),p62蛋白表达下调(P<0.05),自噬水平明显增强.氯喹处理后能明显抑制共培养给药组的细胞增殖(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05),下调Bcl-2/Bax比值(P<0.01).结论 M2-TAMs可通过促进SMMC-7721细胞自噬,降低索拉菲尼对肝癌细胞的增殖抑制作用,因此抑制自噬可能是逆转肿瘤微环境诱导索拉菲尼治疗耐药的新靶点.
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HPLC-MS/MS同时检测大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑的浓度
目的 建立并应用同时测定大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑浓度的液相质谱联用方法(HPLC-MS/MS),研究阿托伐他汀单独给药及与伏立康唑联合给药后,大鼠体内阿托伐他汀的药动学变化以及伏立康唑的浓度变化.方法 采用醋酸钠酸化,甲基叔丁基醚液-液萃取法处理血浆样品,经Thermo Hypersil Gold C18(2.1×100 mm,1.9μm)色谱柱分离,流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱,分析时间6 min;质谱检测采用加热电喷雾离子源(H-ESI)正离子扫描方式,选择反应监测(SRM)模式检测,选用m/z559.2→440.2(阿托伐他汀)、m/z350.2→281(伏立康唑)、m/z370.2→252(内标兰索拉唑)作为定量分析的离子.结果 阿托伐他汀在0.01～100 ng/mL(r=0.9957),伏立康唑在0.025～100 ng/mL(r=0.9966)范围内线性关系良好,阿托伐他汀和伏立康唑的日间和日内精密度均小于13％,提取回收率66.50％～82.67％,血浆样品稳定性符合测定要求.单独给药和联合给药后大鼠血浆中阿托伐他汀的AUC0-24 h分别为(438.78±139.61)和(927.43±204.12))h·μg·L-1,CLz/F分别为(23.89±8.14)和(10.43±2.58)L·h-1·kg-1,Cmax分别为(149.62±131.10)和(159.37±36.83)μg·L-1,t1/2分别为(5.08±1.63)和(5.58±2.11)h,Tmax分别为(0.37±0.14)和(3.60±1.52)h,其中AUC0-24 h和CLz/F,Tmax具有显著性差异(P<0.05).同时可测定合并给药组中伏立康唑的血药浓度.结论 本方法简单快速,灵敏度高,可用于同时检测大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑的浓度.伏立康唑和阿托伐他汀联用,使阿托伐他汀的部分药代动力学参数发生了改变.
关键词： 阿托伐他汀 伏立康唑 HPLC-MS/MS 药代动力学 相互作用 -
地尔硫卓上调异黏蛋白在肝癌细胞中的表达
目的 研究钙离子通道抑制剂逆转肝癌细胞多药耐药和对异黏蛋白表达的影响及分子机制.方法 采用不同浓度钙离子抑制剂(0、25、50、100、200、400μmol/L)干预肝癌MHCC97H、7402细胞不同时间(12、24、48 h)后,用体外细胞划痕实验检测处理后肝癌细胞运动迁徙能力;采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测钙离子抑制剂对肝癌细胞中P-gp和异黏蛋白的表达的影响.结果 钙离子抑制剂能够一过性抑制肝癌MHCC97H、7402细胞的迁徙运动能力,且具有一定的时间和浓度依赖性特点(P<0.05).同时,不同浓度钙离子抑制剂盐酸地尔硫卓均能一过性上调肝癌MHCC97H、7402细胞中异黏蛋白mRNA和蛋白的表达(P<0.05),但并不抑制P-gp蛋白的表达.结论 钙离子抑制剂地尔硫卓能一过性抑制MHCC97H、7402肝癌细胞的迁徙运动,并能反馈性上调促癌基因异黏蛋白mRNA和蛋白的表达水平.因而,采用钙离子抑制剂很可能具有增加肿瘤进展的潜在风险.
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中国城镇居民亚健康评定量表的常模构建
目的 建立中国城镇居民亚健康评定量表(SHMS V1.0)的常模.方法 采用多阶段分层抽样方法,选取全国六个地区,包括华北地区的天津市、华南地区的广东省、中南地区的安徽省、西南地区的四川省、西北地区的兰州市和东北地区的哈尔滨市共15066名城镇居民进行亚健康状况的流行病学调查.在分析中国城镇居民SHMS V1.0评分特点的基础上建立均数常模、百分位常模和划界常模.结果 分性别和年龄组(14～19岁,20～29岁,30～49岁,50～64岁和≥65岁)建立了中国城镇居民亚健康评定量表总分及生理亚健康、心理亚健康和社会亚健康子量表得分的均数常模、百分位常模,并分别以x±S和x±0.5 S为界将中国城镇居民的健康状况按亚健康评定量表总分从低到高依次划为疾病、重度亚健康、中度亚健康、轻度亚健康和健康5种状态.结论 构建了中国城镇居民亚健康评定量表常模,为中国城镇居民亚健康状态的快速筛查和诊断提供参考依据,也为进一步探讨亚健康现患率及其影响因素奠定了理论基础.
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巴西苏木素对舌癌Tca8113细胞凋亡和自噬的影响及分子机制
目的 探讨巴西苏木素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其分子机制,为临床用药提供理论依据.方法 用MTT法检测巴西苏木素对Tca8113细胞的增殖作用;Hoechst33342染色法观察细胞形态变化;Annexin V/PI双染色检测巴西苏木素对Tca8113细胞凋亡程度的影响;Western blot法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、cleaved caspase3及自噬相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B、p62的表达;使用AMPK通路抑制剂与巴西苏木素共同作用于Tca8113细胞,并检测通路相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B的表达.结果 MTT结果表明,巴西苏木素能明显抑制Tca8113细胞的增殖,24 h时IC50为31.17μmol/L;Hoechst33342染色结果显示,巴西苏木素能使Tca8113细胞发生凋亡形态学改变,且与浓度正相关;Annexin V/PI染色结果显示,不同浓度巴西苏木素作用24 h后,细胞凋亡数和凋亡率均高于空白对照组;Western blot检测相关蛋白表达结果表明,巴西苏木素可抑制抗凋亡蛋白bcl-2,促进凋亡关键蛋白bax和cleaved-caspase3的表达,同时增加LC3B和p-AMPK的表达,降低p62和p-mTOR表达.在与抑制剂合用后,p-AMPK与LC3B表达量虽仍略高于空白对照组,但与单纯使用巴西苏木素相比均明显降低,而p-mTOR的表达较巴西苏木素组则明显升高(P<0.05).结论 巴西苏木素能抑制Tca8113细胞增殖并促进其凋亡,同时可通过AMPK/mTOR通路诱导细胞发生自噬.
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长片段非编码RNA XIST可改变人鼻咽癌HNE1细胞对顺铂的耐药性
目的 明确长片段非编码RNA(lncRNA)X失活特异性转录本(XIST)对人鼻咽癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能的机制.方法 通过荧光定量PCR检测人鼻咽癌顺铂耐药HNE1细胞株(HNE1/DDP)中XIST的表达特征.采用MTT试验观察XIST上调和下调对HNE1/DDP细胞DDP耐药性的影响,并通过EdU试验和流式细胞技术观察其对HNE1/DDP细胞增殖和凋亡的影响.采用蛋白质印迹法检测XIST上调和下调对促凋亡因子程序性细胞死亡4(PDCD4)和Fas配体(Fas-L)蛋白表达的影响.结果 XIST在HNE1/DDP细胞的表达量显著高于HNE1细胞(0.57±0.06 vs 0.1±0.02,P<0.05).下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性(P<0.05),而上调XIST增加对DDP的耐药性(P<0.05).下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞增殖(6.17±1.93 vs 16.594.86,P<0.05)并诱导细胞凋亡[(18.04±4.72)％vs(4.22±1.65)％,P<0.05],而上调XIST增加细胞增殖(25.40±7.21 vs 13.16±3.95,P<0.05)并抑制细胞凋亡[(2.82±0.88)％vs(6.46±1.75)％,P<0.05].下调XIST的表达显著增加HNE1/DDP细胞中PDCD4(4.10±0.42 vs 1.0±0.12,P<0.05和Fas-L(3.070.29 vs 1.0±0.14,P<0.05)蛋白的表达,而上调XIST降低PDCD4(0.36±0.11 vs 1.0±0.18,P<0.05)和Fas-L(0.17±0.09 vs 1.0±0.21,P<0.05)蛋白的表达.结论 XIST在HNE1/DDP细胞中表达升高,下调和上调XIST的表达可分别降低和增加HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与PDCD4和Fas-L蛋白表达改变相关.
关键词： X失活特异性转录本 顺铂 人鼻咽癌顺铂耐药HNE1细胞株 耐药性 蛋白 -
利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株
目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.
关键词： G6PD CRISPR/Cas9 基因敲除 HEK293T细胞 -
沉默RRM1可逆转乳腺癌细胞MCF-7/R对紫杉醇的耐药性
目的 阐明沉默核苷酸还原酶M1亚基(RRM1)对乳腺癌耐药细胞MCF-7/R逆转耐药的作用.方法 通过高浓度紫杉醇诱导耐药株MCF-7/R;运用Kaplan-Meier Plotter绘制RRM1基因的生存曲线;通过siRNA沉默MCF-7/R细胞中RRM1基因表达,并用Western blot和qRT-PCR方法检测蛋白和基因水平的表达,筛选出高效特异的si-RRM1序列;将该si-RRM1序列转染MCF-7/R细胞,筛选得到能稳定抑制RRM1基因表达的细胞株MCF-7/R/siRNA;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测RRM1沉默后MCF-7/R细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期和凋亡,并观察周期、凋亡相关蛋白的变化;构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默RRM1后给予紫杉醇治疗对裸鼠体内抑瘤效果的影响.结果 生存曲线分析显示RRM1基因表达与乳腺癌患者的生存率呈负相关(P=0.000);MCF-7/R细胞中证实RRM1蛋白和mRNA表达水平较MCF-7细胞均显著升高(P<0.01);si-RRM1序列筛选中,转染si-RRM1-04组细胞的RRM1蛋白和mRNA表达量降低为显著(P<0.001);沉默RRM1后,MCF-7/R细胞对紫杉醇的敏感性显著增加,细胞晚期凋亡比例明显升高(P<0.001),同时降低Akt蛋白的磷酸化并抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进p53蛋白表达水平的增加(P<0.001);裸鼠实验显示,与si-NC组相比,沉默RRM1后给予紫杉醇治疗可显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长(P<0.001).结论 沉默RRM1可通过诱导细胞凋亡增加提高MCF-7/R细胞化疗敏感性,逆转乳腺癌紫杉醇化疗耐药.
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沉默CIT基因可抑制前列腺癌细胞的增殖和转移
目的 探究Citron Rho-interacting serine/threonine kinase(CIT)基因在前列腺癌中的表达特点,并探讨CIT基因对PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力的调控作用及其可能的分子机制.方法 利用TCGA和MSKCC数据库分析CIT在前列腺癌组织的表达水平和临床相关性.采用siRNA干扰CIT的表达,采用CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测CIT对前列腺癌PC-3细胞系的增殖、迁移和侵袭特性的影响.采用Western blotting检测CIT对上皮-间质转化和Hippo-YAP通路的调控作用.结果 TCGA数据库分析表明,CIT在前列腺癌组织中表达显著上调(P<0.05);MSKCC数据库分析表明,CIT表达水平与N分期(P<0.05)、M分期(P<0.001)、Gleason评分(P=0.010)和PSA水平(P=0.004)成正相关关系.PC-3细胞中沉默CIT表达可显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,逆转上皮-间质转化进程,并抑制Hippo-YAP通路的激活.结论 CIT基因可能是前列腺癌的致病基因,其分子机制可能与Hippo-YAP通路的激活有关.
关键词： 丝/苏氨酸激酶 前列腺癌 转移 上皮-间质转化 Hippo-YAP通路
