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喹诺酮类新药KNT和盐酸莫西沙星肝毒性的比较研究
目的 采用大鼠原代肝细胞模型评价盐酸莫西沙星(Mox)和喹诺酮类新药KNT的体外肝毒性.方法 胶原酶二步灌流法分离制备SD大鼠肝细胞,进行原代培养.Mox和KNT分别设1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg·mL-1剂量组,同时设溶剂对照组,处理24 h后,检测对比肝细胞活力IC50、AST、胞内LDH泄漏情况、GSH含量变化及两药物不同浓度处理后受损的肝细胞线粒体在电子显微镜下状态的对比.结果 KNT的细胞生长抑制率IC50=0.773 mg· mL-1,显著低于Mox(IC50=1.144 mg·mL-1).Mox在0.8 mg·mL-1剂量处理24 h后,对大鼠原代肝细胞生长抑制率约69％,培养液上清AST和LDH水平显著升高,肝细胞GSH含量显著降低,电镜观察到肝细胞内绝大部分线粒体肿胀,嵴断裂消失;而Mox在0.4 mg·mL-1剂量下,细胞生长抑制率约8％,AST、LDH和GSH含量无明显改变.经0.8 mg· mL-1 KNT处理24 h后,对细胞生长抑制率约9％,培养液上清AST、LDH水平显著低于0.8 mg· mL-1 Mox的,与空白对照比有上升趋势,GSH水平也显著上升,电镜观察到肝细胞核轻微固缩,部分线粒体肿胀.在0.4 mg· mL-1 KNT剂量下,细胞生长抑制率约1％,AST、LDH和GSH含量无明显改变.结论 同剂量下,KNT处理大鼠原代肝细胞24 h后,表现出比Mox肝细胞毒性弱.
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聚乙二醇修饰对苦瓜核糖体失活蛋白的肝细胞毒性影响
目的 探讨聚乙二醇(PEG)修饰对α型苦瓜核糖体失活蛋白(α-momorcharin,α-MMC)的大鼠肝细胞毒性的影响.方法 将SD大鼠随机分为生理盐水阴性对照组,α-MMC高、中、低剂量组(蛋白含量分别为6.25、2.08、0.70 mg/kg)和PEG修饰后的α-MMC-PEG高、中、低剂量组(蛋白含量相同),每组24只,隔日经尾静脉注射给药一次,连续28 d,停药后恢复14d,观测动物的一般状况,并分别在给药期末和恢复期末进行肝功能和肝组织病理学检查.结果 在给药第28 d,与生理盐水阴性对照组比较,α-MMC高、中剂量组有明显的肝功能异常,如血清白蛋白(ALB)含量降低,血清球蛋白(GLB)增加,A/G比值降低,谷草转氨酶(AST)、总胆红素(BIL)和胆固醇(CHO)增加;HE染色可见弥散性肝细胞水肿、变性,炎性细胞浸润,甚至点状坏死.与α-MMC不同,经PEG修饰后的α-MMC-PEG各组的毒性则明显减轻,其高剂量组肝功损害指标及病理改变仅与α-MMC低剂量组接近,而中剂量和低剂量组与阴性对照组一致.结论 PEG修饰能够明显降低α-MMC对大鼠的肝细胞毒性.
关键词： α型苦瓜核糖体失活蛋白 PEG修饰 肝细胞毒性 -
人源HepaRG肝细胞毒性与遗传毒性高通量筛选方法的初步建立
目的 利用正常人源肝细胞(HepaRG)和高内涵技术检测肝毒性标志物,并结合微核试验和单细胞凝胶电泳试验建立体外细胞毒性和遗传毒性的快速筛选平台.方法 选取适当的荧光探针Hoechst33342、DCFH-DA、Fluo4-AM、MitoTracker(R) Red CMX Ros联合高内涵技术研究不同大黄蒽醌类单体(AQs)对HepaRG细胞活性氧簇(ROS)、胞内Ca2+含量及线粒体膜完整性等肝毒性标志物的影响,并开展高内涵法胞质分裂阻断法微核试验和高通量彗星电泳试验,综合评价AQs致肝细胞毒性及染色体、DNA损伤情况.结果 与对照组比较,HepaRG细胞经25.0 μg/mL大黄素、12.5和25.0μg/mL芦荟大黄素、50和25.0 μg/mL大黄酚处理24h后,胞内ROS含量显著增多;12.5和25.0 μg/mL芦荟大黄素和50.0μg/mL大黄酸可引起胞内Ca2+含量显著增多;大黄素25.0 μg/mL、芦荟大黄素25.0 μg/mL、大黄酚50.0和25.0 μg/mL、大黄酸50.0和25.0 μg/mL组导致线粒体明显损伤(P＜0.05、0.01).与对照组比较,25.0 μg/mL大黄素诱导微核率、尾DNA含量和彗星尾距(OTM)数值均显著升高(P＜0.05、0.01);50.0 μg/mL大黄酚给药72 h后微核率显著升高(P＜0.01).结论 AQs的研究结果与现有文献报道基本相符.本研究成功建立肝细胞毒性和遗传毒性的联合快速筛选模型,有助于药物研发早期的毒性筛选.
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曲格列酮对HepG2及CD133+肝癌干细胞的毒性差异研究
目的 分离与鉴定肝癌细胞HepG2中CD133标记的肝癌干细胞(LCSC),初步探讨曲格列酮(Tro)对HepG2及CD133+LCSC的细胞毒性差异.方法 利用流式细胞仪分选纯化HepG2中的CD133+和CD133细胞,采用悬浮微球形成法、平板克隆形成法、Transwell侵袭和迁移实验检测HepG2、CD133+和CD133细胞的自我更新能力;BALB/c裸鼠体内成瘤实验检测HepG2和CD133 LCSC细胞的成瘤能力;流式细胞术检测HepG2、CD133+ LCSC细胞周期,MTT法测定其对索菲替尼的耐药性;MTT法检测Tro对HepG2、CD133+ LCSC的毒性情况,全自动生化分析仪测定其对细胞上清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和总蛋白(TP)水平的影响,荧光法检测Tro对细胞CYP450总活性和ROS水平的影响.结果 CD133标记的CSC在HepG2中占(0.72±0.05)％,CD133+细胞分选后纯度为98.7％;CD133+细胞微球形成能力、克隆形成能力以及Transwell迁移与侵袭能力、肿瘤形成能力明显高于亲本(P＜0.05、0.01);CD133+细胞群大多处于G0/G1期,G2/M期未阻滞,并且对索菲替尼表现较大耐药性(P＜0.05、0.01);Tro处理12、24、48、72 h后,CD133+ LCSC半数抑制浓度(IC50)显著低于HepG2 (P＜0.05、0.01);80 μmol/LTro处理48 h时,LCSC上清AST、TP、LDH、ALB、BUN生化指标不同程度升高,CYP450总活性和ROS水平出现明显抑制(P＜0.05、0.01).结论 成功筛选和鉴定具有高增殖能力的CD133+ HepG2 CSC,其在Tro引起肝细胞毒性方面较HepG2细胞更敏感,细胞毒性差异显著,为Tro靶向CD133+ LCSC的细胞毒性研究提供新思路.
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大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响
目的:研究大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响.方法:利用大鼠肝微粒体对何首乌水提物进行体外代谢;将经代谢前后的何首乌水提物溶液冷冻干燥,以不同浓度(相当于生药1.5、3、6、12 mg/mL)分别作用肝L02及HepG2细胞24h及48 h,MTT法检测其对两种细胞活力的影响;HPLC测定何首乌水提物溶液中3种主要成分(二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黄素)的含量变化.结果:何首乌水提物代谢后,随着其剂量的增加,对细胞活力的抑制作用逐渐增强,与何首乌水提物未代谢组相比,浓度为12 mg/mL的何首乌水提物代谢组毒性明显降低(P＜0.01).HPLC测定结果显示,何首乌水提物代谢组上述3种主要成分含量均有所降低.结论:何首乌水提物经大鼠肝微粒体代谢后对肝细胞毒性降低,与其主要成分含量降低之间的关系需要进一步研究.
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PP2A-B56γ高表达抑制镉诱导的人肝L02细胞DNA损伤
目的:探讨人正常肝细胞内蛋白磷酸酶2A-B56γ亚基(PP2A-B56γ,由PPP2R5C基因编码)高表达对镉诱导相关基因转录水平和DNA损伤效应的影响,并探讨其作用机制.方法:构建PP2A-B56 γ高表达L02-2R5Cc和空白载体对照L02-pBabe细胞模型；两种细胞分别给予CdCl2(Cd)、TNFα单独处理及联合处理后,实时荧光定量-PCR(QRT-PCR)检测不同处理组PPP2R5C和金属硫蛋白1B (MT1B) mRNA转录水平；彗星试验(SCGE)检测细胞DNA断裂损伤情况；并按照3×2的析因设计分析不同处理之间是否存在联合作用及作用类型.结果:与L02-pBabe细胞相比较,L02-2R5Cc细胞中PPP2R5C、外源性PPP2R5C-FLAG mRNA显著高表达(P＜0.05),细胞株构建成功.3种因素单独处理时,与阴性对照组相比,Cd降低PPP2R5C、升高MT1B mRNA表达,PPP2R5C基因高表达诱导的效应与Cd处理相反,TNFα降低PPP2R5C和MT1B mRNA表达(均P＜0.05)；析因分析表明,在PPP2R5C和PPP2R5C-FLAG mRNA检测中,PPP2R5C高表达与Cd、与TNFα之间均存在协同性交互效应(P＜0.05)；在MT1B mRNA检测中,PPP2R5C高表达与Cd和TNFα之间均表现为拮抗作用,PPP2R5C高表达与TNFα为协同抑制作用(均P＜0.05).SCGE检测表明,与阴性对照相比,Cd诱导彗星尾长、尾矩、尾部DNA含量和拖尾细胞阳性率显著增高(P＜0.05),TNFα、PPP2R5C高表达单独作用均不引起DNA损伤(P＞0.05),但两两联合作用的析因分析结果表明,TNFα预处理与Cd处理对DNA损伤具有协同作用,PPP2R5C高表达与Cd处理存在拮抗作用,交互作用均具有统计学意义(P＜0.05).结论:Cd抑制肝细胞PPP2A-B56γ编码基因的转录并显著诱导DNA损伤,PP2A-B56γ高表达抑制镉诱导的DNA损伤,而炎症因子可增强镉对细胞DNA的损伤.
关键词： 蛋白磷酸酶2A (PP2A) 调节亚基B56γ 镉 肝细胞毒性 基因转录调控
