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MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性
背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程.因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础.目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性.方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性.结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明 pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究.
关键词： 表达载体 MicroRNA-125a 表达鉴定 pSuper 质粒 -
p21 RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定
目的:构建抑制p21基因表达的pSUPER RNAi载体(pSUPER-p21)并鉴定其功能.方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经Bg1 Ⅱ、HindⅢ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-p21).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达.结果:pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调.结论:靶向p21的pSUPER RNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达.
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RNA干扰基因敲除MAGE-1在恶性胶质瘤U87细胞中的初步研究
目的:通过构建抑制MAGE-1的短片段双链核糖核酸(siRNA)表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系U87细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用.方法:化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆至经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建核糖核酸干扰(RNAi)质粒载体.利用RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后胶质瘤U87细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干涉效果.结果:重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功地插入至预计位点,且序列与预期完全一致.稳定转染后G418筛选出的U87多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干扰作用.结论:载体的成功构建并能对U87细胞中的MAGE-1分子进行RNAi,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的作用,分析基因功能,展开肿瘤基因治疗奠定了基础.
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靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定
目的 利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPERhole)及筛选稳定产毒的细胞克隆.方法 化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-hole).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果.结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达.结论 靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功.
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人类心脏发育候选基因KLHL31RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定
目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类心脏发育候选基因KLHL31表达的pSUPER RNAi载体( pSUPER-KLHL31).方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向心脏发育候选基因KLHL31的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER -KLHL31),通过酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.通过Western blotting检测转染pSUPER-KLHL31后细胞中KLHL31蛋白的表达量.结果:pSUPER-KLHL31载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,且序列完全一致；重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功；Western blotting检测结果显示转染pSUPER -KLHL31的细胞中KLHL31蛋白表达量明显降低.结论:靶向KLHL31的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨KLHL31在心脏发育中的功能奠定了基础.
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pHsa-m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定
目的 构建肝脏特异性的微RNA-miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定.方法 经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA-miR-122的前体序列,引入酶切位点和Poly T转录终止序列,将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中.将构建载体进行酶切、测序鉴定,再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后,经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测,鉴定载体功能性表达.结果 miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上.且可表达出具有生物活性的miR-122,将该真核表达载体命名为pHsa-m122.结论 成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122,有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用.
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Runx1-shRNA重组质粒的构建与表达
本研究目的在于构建特异性下调人Runx1基因的shRNA表达质粒.设计并合成人Runx1基因的siRNA,通过DNA重组技术将目的序列插入到pSuper质粒,采用菌落PCR、限制性内切酶酶切技术及测序方法对其进行筛选与鉴定.转染该质粒于人肺腺癌细胞A549,通过实时荧光定量PCR技术和Western blot方法分别从基因及蛋白水平对其进行功能鉴定.实验结果表明我们所构建的pSuper-Runx1-shRNA质粒能够有效抑制A549细胞Runx1 mRNA和蛋白的表达,抑制率分别为33％和50％.
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质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性
为了探讨靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体是否具有抑制HeLa细胞端粒酶活性的能力,人工合成2条64个核苷酸(nt)的片段,其中19nt与hTERT基因1789-1807位碱基同源,将其退火、连接到质粒pSUPER中,构建pSUP-hTE.在pSUP-hTE基础上,把该质粒的启动子和64nt插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP-C1中生成pEGFP- hTE,从而获得新霉素抗性筛选质粒.将pEGFP- hTE用脂质体转染HeLa细胞,G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代,用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、HeLa细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力.结果显示,pEGFP-hTE转染的HeLa细胞与对照组比较,hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38%,但细胞增殖能力没有明显改变.以上结果表明, pEGFP-hTE能通过RNA干扰(RNAi)途径特异性抑制HeLa细胞hTERT基因的表达,从而有效抑制细胞端粒酶活性,这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径.
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抑制端粒酶活性的pSUPER RNAi系统的构建
目的构建抑制端粒酶活性的siRNA表达载体.方法化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向端粒酶hTERT基因的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgIⅡ、HindⅢ双酶切同时CIP处理后的pSUPER载体的polⅢH1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立非特异对照.结果重组构建的pSUP-hTE载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.结论载体的成功构建,为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础.同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法,这项技术能广泛的用在分析基因功能、肿瘤治疗等,更加便捷地把RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究.
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针对MAGE-1的pSUPER RNAi系统的构建
目的构建抑制MAGE-1的siRNA表达载体.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向MAGE-1基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火,克隆到经BglⅠ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNAi质粒.通过双酶切鉴定及基因片段序列分析验证构建效果.结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.结论载体的成功构建,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的功能打下基础,可用于分析基因功能、肿瘤治疗等.
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针对MAGE-1基因RNAi在恶性胶质瘤SHG-44细胞中的作用研究
目的构建抑制黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)的siRNA表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNA干涉 (RNAi)质粒载体.利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后SHG-44细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干扰效果. 结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功插入到预计位点,并且序列与预期完全一致.稳定转染后G418筛选出的SHG-44多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干涉作用. 结论成功构建了针对MAGE-1基因的siRNA表达载体,抑制SHG-44细胞中的MAGE-1分子的表达.
