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CM-DIL和DAPI标记的骨髓间充质干细胞
背景：在有关“细胞移植”的实验研究中，细胞标记技术被广泛应用。CM-DIL与DAPI是细胞标记实验中常用的荧光染料，目前两者的对比研究报道较少。
目的：从体外实验与体内实验两方面，探讨两种荧光染料CM-DIL与DAPI在标记大鼠骨髓间充质干细胞方面的差异。
方法：用贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，分别用CM-DIL与DAPI进行标记，锥虫蓝计数检测骨髓间充质干细胞的活力；MTS法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力并绘制增殖曲线；倒置相差荧光显微镜下动态观察标记后1，2，3代骨髓间充质干细胞的荧光衰减情况。结扎SD大鼠冠状动脉前降支致心肌梗死。1周后于心肌梗死边缘处注射CM-DIL与DAPI标记的细胞，细胞移植后3 d取材观察骨髓间充质干细胞的分布情况。
结果与结论：体外实验中，CM-DIL与DAPI标记的骨髓间充质干细胞两者的早期增殖能力均低于对照组；两种染料标记后的第1代细胞的荧光阳性率均为100%，但DAPI标记后的第3代细胞的荧光强度明显减弱。体内实验中，CM-DIL组与DAPI组心肌组织冰冻与石蜡切片均检测到集中分布的荧光；CM-DIL组冰冻切片红色荧光比DAPI组的蓝色荧光边界清晰并且背景低；CM-DIL组还可以通过含细胞核染色的封片剂封片排除荧光假阳性。可见，CM-DIL染料比DAPI更适合对骨髓间充质干细胞进行体内示踪。 -
聚乙二醇修饰载血管紧张素转化酶RNA壳聚糖纳米粒治疗高血压
背景：临床治疗原发性高血压的传统降压药物一般半衰期较短，且治疗效果不佳。壳聚糖可以作为基因载体，将目标基因载入机体起到靶向治疗作用。聚乙二醇与DNA结合形成纳米粒后，可以起到表面保护效果，稳定纳米粒，使其在体内保持长循环。目的：探讨聚乙二醇修饰的载血管紧张素转化酶RNA壳聚糖纳米粒注射到自发性高血压模型大鼠体内后，对模型大鼠的降压疗效以及对心脏组织的影响。方法：实验共分为5组，取32只自发性高血压大鼠随机分为4组，为模型组、壳聚糖组、实验组、阳性药物组，每组8只；取8只正常大鼠，不作处理作为对照组。分组后分别于实验第1，10天进行给药2次，其中模型组和对照组尾静脉注射等量的生理盐水，壳聚糖组尾静脉注射1 mg/kg壳聚糖，实验组尾静脉注射1 mg/kg的聚乙二醇修饰载血管紧张素转化酶RNA壳聚糖纳米粒，阳性药物组灌胃0.5 mg/kg盐酸贝那普利。结果与结论：①血压水平：大鼠注射修饰的壳聚糖纳米粒后第3天，与第1天比血压显著下降(P<0.05)；②组织学变化：实验组主动脉、肾脏及心脏组织切片显示均有绿色荧光表达，和血管紧张素转换酶的体内分布基本一致；③RT-PCR检测及左室功能检测：注射后第3天，与模型组相比，实验组各组织器管中血管紧张素转换酶mRNA表达水平及心肌肥厚相关指标减少(P<0.05)、心肌细胞肥大现象均有显著的减轻(P<0.05)；④结果证实，聚乙二醇修饰的载血管紧张素转化酶RNA壳聚糖纳米粒可以降低高血压模型大鼠的血压值和修复受损心脏，其作用机制可能与血管紧张素转移酶有关。
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pEGFP-ORF2质粒在Vero细胞中的有效表达
目的:确立pEGFP-ORF2质粒在不同细胞密度,不同转染时间,及血清存在与否时在细胞中的有效表达,为进一步研究HSV-2LAT ORF2对细胞的作用,及阐明HSV-2潜伏复发机制打下基础.方法:采用脂质体法将pEGFP-ORF2与pEGFP-C2两个真核表达载体转染Vero细胞,观察荧光蛋白表达.结果:有无血清对转染效果无明显差异.在细胞密度为4.0×104cells/ml,转染后84h EGFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下pEGFP-ORF2与pEGFP-C2的表达无明显差异.结论:血清对表达效果的影响不大,细胞的接种密度及转染时间对转染有明显作用,以荧光蛋白作为标签鉴定蛋白表达的方法切实可行.
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NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响
探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响.采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的霞组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱.说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路.
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带绿荧光蛋白的人类免疫缺陷病毒被膜蛋白gp160的表达
人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)被膜蛋白Env是HIV感染和HIV免疫研究中的一个重要部分[1],通过表达前体蛋白gp160,经蛋白酶裂解形成Env蛋白的膜外部分gp120和跨膜部分gp41.随着分子克隆技术的应用,已有许多gp160和gp120表达结构被合成.但需要特殊的标记技术才能快速、敏感、特异和直观地反映Env成分的表达.本研究旨在结合增强的绿荧光蛋白(EGFP)的荧光表达[2],尝试合成适合于定性、定量和定位测定的gp160表达结构.
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携带 EGFPC3 质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达
目的 构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达.方法 将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达.结果 在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达.在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的.用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变.免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达.结论 表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型.
关键词： 增强型绿色荧光蛋白C3 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 荧光表达 -
转基因MSC体内外荧光表达的对比研究
目的:探讨转基因MSC在体内外表达荧光是否存在差异及可能的影响机制.方法:用转基因MSC输注到受射线照射的雌性BALB/C小鼠体内,输注后1、7、14、21、28、35天处死小鼠留取胸腺左叶,制作快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察荧光表达,同时对比观察体外培养转基因MSC的荧光表达情况.结果:小鼠体内的转基因MSC在输注后1天开始出现荧光,第7天达高峰,第35天消失；体外培养的MSC制备后10h可见绿色荧光表达,第7天后表达率高,第28天基本消失.结论:转基因MSC体内荧光表达优于体外,其机制与微环境及培养方式有关.
