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重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定
目的:以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗.方法:将MUC1基因连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌,通过IPTG 诱导MUC1表达,经Western blot鉴定,Amylose 亲和层析纯化蛋白.用MUC1-MBP免疫健康C57BL/6小鼠,测定其免疫活性,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性,通过3H-TdR掺入法测定T细胞增殖能力.结果:成功构建了pMAL-MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达,纯化了MUC1蛋白.经重组MUC1-MBP免疫的C57小鼠,血清抗MUC1抗体的效价为1:5 760±3 221; 脾CTL 对MCF-7 及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为47.7%±4.3%和67.5%±6.5%.结论:人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗.
关键词： 重组人MUC1-MBP 融合蛋白 CTL活性 肿瘤疫苗 -
基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定
目的:制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性.方法:将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IFTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Mucl的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP.将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌.结果:获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白.Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为(74.5±5.9)%和(60.5±10.4)%,与对照组比P<0.05,差异显著;Mucl.MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞.结论:成功制备莺组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用.
关键词： 鼠Muc1 Muc1-MBP融合蛋白 CTL活性 异种同源蛋白 肿瘤疫苗 -
重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用
目的:研究重组人MUC1-MBP的抗肿瘤作用.方法:用重组人MUC1-MBP皮下注射途径免疫健康鼠,采用MTT法测定小鼠抗MUC1特异的CTL活性;通过免疫鼠成瘤及荷瘤鼠治疗实验检测其对肿瘤的预防和治疗作用.结果:MUC1-MBP免疫鼠CTL对MCF-7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为(47.7±4.3)%和(67.5±6.5)%;免疫鼠成瘤结果免疫组小鼠共长5个肿瘤,存活时间明显延长,对照组共长51个,平均生存时间23 d;荷瘤鼠治疗结果显示治疗组小鼠肿瘤平均体积386mm3,对照组小鼠肿瘤平均体积4 000 mm3.结论:重组人MUC1-MBP具有明显的治疗、预防肿瘤和抑制肿瘤转移的作用,有希望发展成人类抗肿瘤疫苗.
关键词： Muc1-MBP融合蛋白 CTL活性 肿瘤疫苗 -
人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察
目的 通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响.方法 用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原核表达载体.将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达;将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况.并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白.然后,采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HLA-A*0201转基因小鼠,LDH方法检测CTL活性.结果 酶切结果证实,成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体,并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达,原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体.用DNA疫苗进行初次免疫,镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后,可成功地诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性.结论 成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原,为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础.
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HCV结构区DNA疫苗诱发小鼠特异性细胞免疫反应的研究
目的通过HCV结构区DNA疫苗直接免疫小鼠,诱发其体内特异性细胞介导的免疫反应的研究,为HCV DNA疫苗的研制打下基础.方法用重组的pBK-CMV质粒体外转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,建立了能体外表达HCV结构区蛋白的SP2/0D细胞系,分别用SP2/0和SP2/0D细胞攻击用空质粒或pBK-CMV质粒免疫过的Balb/c小鼠,通过肿瘤形成、肿瘤重量、肿瘤组织淋巴细胞的浸润以及不同免疫组小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量来观察小鼠体内T淋巴细胞的活性.结果用SP2/0和SP2/0D攻击空质粒或pBK-CMV质粒免疫过的小鼠15 d后,SP2/0D攻击的pBK-CMV质粒免疫鼠肿瘤重量(0.9±0.12)g明显低于空白质粒免疫组和SP2/0接种组(P＜0.001),且该免疫组小鼠血清中IL-2和IFN-γ的浓度明显高于其它免疫组;此外,用SP2/0D攻击的pBK-CMV免疫鼠,肿瘤病理切片中可见明显的T淋巴细胞浸润.结论重组的HCV结构区DNA疫苗(pBK-CMV)能诱导小鼠体内特异性T淋巴细胞反应,HCV DNA疫苗可能为临床疾病的治疗和预防提供一种新的途径.
