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人C1酯酶抑制剂活性动态显色检测方法的建立及验证
目的 建立人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor or Cl inhibitor,C1-INH)活性的动态显色检测方法,并进行验证.方法 采用棋盘法分析C1酯酶与发色底物C1E 5603[CH30C-Lys(Cbo)-Gly-Arg-pNA· AcOH]反应后的A值变化率(△A/min),确定能使不同浓度酶饱和的低底物浓度.将C1-INH浓缩制剂标准品与C1酯酶孵育,剩余的C1酯酶与底物C1E 5603作用产生A值,将△A/min与C1-INH活性进行拟合,绘制标准曲线.验证该方法的线性范围、选择性、特异性、准确度、精密度、稳定性,并进行样品添加试验.将验证后的该方法应用于C1-INH制备工艺过程样品的分析.结果 确定C1酯酶的浓度为28 μg/mL,底物浓度为2.4 mmol/L,反应结果监测4 min.C1-INH标准品在0.15～0.025 IU/mL范围内与△A/min呈良好的线性关系,R2≥0.99,校正标样回算浓度在标示值的90.2％～105.4％内;CM阳离子交换层析洗脱缓冲液、HIC疏水层析平衡缓冲液、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)、人纤溶酶(plasmin,Plm)的响应值均低于定量下限响应的7.2％,并低于内标响应的2.7％;20 mmol/L以下的pH5.0NaAc及300 mmol/L以下的NaCl对C1-INH活性检测无影响;检测定量上限、高、中、低、定量下限质控样品,批内准确度在90.0％～114.8％之间,批内CV在0.7％～ 13.7％之间,批间准确度在94.2％～108.3％之间,批间CV在1.2％～9.7％之间;C1酯酶与底物C1E 5603室温放置3h不影响检测结果;样品添加试验回收率在94.5％～ 106.1％之间.CM阳离子交换层析洗脱液、DEAE阴离子交换层析洗脱液、HIC疏水层析流穿液中C1酯酶抑制剂的特异性活性逐渐升高,分别为0.79、1.84、2.61 IU/g.结论 本方法具有良好的选择性、准确度、精密度、特异性及稳定性,可作为C1-INH制备工艺中的内部控制指标.
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人C1酯酶抑制剂的研究进展
C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH),又称C1抑制物(C1 inhibitor),是目前已知的唯一一种既能通过经典途径,又能通过凝集素途径对补体系统进行调节的血浆蛋白酶抑制物,其在补体系统、激肽释放酶-激肽系统、纤溶系统和凝血系统中发挥重要的调节作用.目前有4种C 1-INH浓缩制剂批准上市,均用于治疗或预防遗传性血管性水肿(hereditary angioedema,HAE).本文就C1-INH的生化性质与生理功能、相关疾病与临床研究、C1-INH浓缩制剂的制备工艺及产品比较作一综述.
关键词： C1酯酶抑制剂 C1酯酶抑制剂浓缩制剂 遗传性血管性水肿 -
遗传性血管性水肿的治疗进展
遗传性血管性水肿是一种少见的常染色体显性遗传病,因血浆中功能性C1酯酶抑制剂缺乏引起皮下及黏膜水肿.喉水肿诱发呼吸道阻塞可危及生命.该病早期无特效药,曾将治疗荨麻疹的抗组胺药和糖皮质激素等用于急性水肿发作的患者,收效甚微,死亡率高达30%.随着对该病发病机制的深入研究,不断涌现出新的药物,为临床医生及患者提供更多选择.概述其发病机制、临床表现,着重围绕其治疗进展.
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遗传性血管性水肿的研究进展
遗传性血管性水肿是一种由于C1酯酶抑制剂的合成障碍或功能缺陷所致的常染色体显性遗传病.该病尚无满意治疗,但近研究发现其发病的主要介质是缓激肽,故激肽释放酶抑制剂和缓激肽2型受体拮抗剂成为新药研发的热点,为治疗提供了更多的选择.对遗传性血管性水肿的病因及发病机制、临床表现及分型、治疗进行概述.
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遗传性血管性水肿C1INH基因1440V变异及其对结构的影响
目的 通过基因测序了解遗传性血管性水肿(HAE)患者C1酯酶抑制剂(C1INH)基因第八外显子的变异情况.方法 从HAE患者外周血白细胞中提取基因组DNA,PCR扩增第八外显子片段后插入pUC19质粒载体冉转化入感受态大肠杆菌TG1菌株,培养扩增质粒DNA,提取纯化后进行基因测序.将患者血清进行SDS-PAGE及Westem印迹,以了解该变异对CIINH结构的可能影响.结果 在1例I型HAE患者的第八外显子中发现一个变异位点,16776A＞G,致440位的异亮氨酸突变成缬氨酸(1440V),SDS-PAGE及Westem印迹显示该患者血清中C1INH全部表现为96 000片段而非正常的105 000片段.结论 1440v是一个新的C1INH基因变异,位于C1INH反应中心环的P4位,变异可能导致C1INH分子构象发生改变.
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Berinert获准用于治疗遗传性血管水肿急性发作并发症
由CSL Behring公司开发的C1酯酶抑制剂Berinert(C1-INH),为FDA批准的首个用于治疗遗传性血管水肿(HAE)有关的急性腹痛发作以及面部肿胀的药物,已于2009年年底上市.
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C1酯酶抑制剂在危重病中的应用研究进展
C1酯酶抑制剂(C1 INH)是血浆中的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,是目前已知的惟一能与丝氨酸蛋白酶C1s和C1r作用的抑制剂,也是激肽释放酶、活化的凝血因子FXⅡ(FXⅡa)、活化的凝血因子FXⅠ (FXⅠ a)的抑制剂.C1 INH是血浆中高度糖基化的单链糖蛋白,由478个氨基酸残基组成,蛋白质含量为51％,分子量约为104 kDa,共含有20个糖基化位点,位于ASN-330位点的糖基化结构对丝氨酸蛋白酶抑制区折叠效应的形成起重要作用[1].目前,一般将C1 INH分为丝氨酸蛋白酶抑制区和非蛋白酶抑制区两个区域.在分子结构上,蛋白酶抑制区具有9个α螺旋和3个β折叠[2].C1 INH主要在肝脏中合成,其他一些细胞(如单核细胞、巨噬细胞、血小板等)也具有合成能力.在补体系统中,C1 INH主要调节补体的经典活化途径,还可以与C3反应抑制C3b与B因子的结合,从而调节补体的旁路途径.在缓激肽释放系统中,C1 INH是FXⅡa的主要灭活剂,也抑制血浆中激肽释放酶的活性,还抑制前激肽释放酶对HK辅因子的裂解,从而抑制激肽的形成和释放,间接调节缓激肽的水平[3].在遗传性血管性水肿患者的急性发作期,激肽释放酶和FXⅡa直接活化纤维蛋白溶酶原,增强纤溶系统的活化,因此C1 INH对于纤溶系统的活化也具有调节作用.C1 INH还可以灭活47％的FXⅠ a[4],因此可以调节机体的内源性凝血系统.
