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口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性
目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性.方法 以复合多表位表达盒OAAT及Asia Ⅰ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-PI-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法 检测目的 蛋白在HeLa细胞中的表达.进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平.流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平.结果 所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达.免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高.结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答.
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日本血吸虫Mr 23 000抗原与白细胞介素-12多价DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究
目的研究能共同表达日本血吸虫Mr 23000膜抗原(Sj23)与白细胞介素-12(IL-12)的多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23诱导BALB/c小鼠免疫保护作用.方法在多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23和PV-IL12的基础上,构建空白质粒PV和仅表达Sj23的质粒PV-Sj23.50只BALB/c小鼠分为5组,每组10只,分别注射多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23、表达Sj23的质粒PV-Sj23、表达IL-12质粒PV-IL12、空白质粒PV和生理盐水,100μg/只,免疫1次.4周后每只鼠攻击感染40±2条尾蚴,42 d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵数.结果成功地构建了空白质粒PV和只表达Sj23的质粒PV-Sj23及多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23.PV-IL12-Sj23组和PV-Sj23组分别获得了45.5%27.2%的减虫率,两组比较差异有显著性(P＜0.05),减卵率分别为58.4%和33.9%.结论多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23可诱导BALB/c小鼠产生较显著的抗血吸虫免疫保护作用,且保护性效果比单价DNA疫苗PV-Sj23好.
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日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究
目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用.方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNA pcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异.多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均＜0.05).结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答.
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日本血吸虫多价DNA疫苗的构建及鉴定
目的构建含日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)基因和日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30 H链CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6的多价DNA疫苗,并观察该融合基因在真核细胞中表达.方法设计合成连接肽(G1y4Ser)3基因的两条互补单链,退火成双链后克隆到真核表达载体pcDNA3.1,改建为pcDNA3.1-linker.分别将SjCTPI DNA片段及NP30的(CDR3)6DNA片段克隆到连接肽的上游或下游,构建pcDNA3.1-TPI-1inker-(CDR3)6和pcD-NA3.1-(CDR3)6-linker-TPI2种多价疫苗.设计引物分别扩增TPI-1inker-(CDR3)6和(CDR3)6-linker-TPI,再分别插入真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点,绿色荧光蛋白基因的上游,重组质粒用脂质体导入真核细胞COS-7,观察插入基因在真核细胞的表达.结果经双酶切及测序鉴定证实多价疫苗pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI构建成功;构建的pEGFP-N1-TPI-linker-(CDR3)6和pEGFP-N1-(CDR3)6-linker-TPI在导入COS-7细胞后能成功表达.结论日本血吸虫TPI和NP30-(CDR3)6的多价DNA疫苗构建成功,且该融合基因能在真核细胞中表达.
关键词： 日本血吸虫 磷酸丙糖异构酶 NP30-(CDR3)e 多价DNA疫苗 -
日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO2SjFABP-23的构建及其保护性免疫
目的构建日本血吸虫多价DNA疫苗pVIVO2SjFABP-23,并观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用.方法根据Sj FABP和Sj23的基因序列合成两对特异性引物,利用重组PCR技术将日本血吸虫Sj FABP和Sj23的基因片段进行拼接,得到融合基因SjFABP-23,再将该片段重组于p GEM-T载体中,进行PCR扩增及DNA序列测定.然后经双酶切将目的片段SjFABP-23克隆到pVIVO2的一个多克隆位点上转化E.coli GT 110获得重组质粒pVIVO2SjFABP-23,免疫小鼠进行免疫保护性实验.结果 PCR扩增出一条大小约为1.1Kb的目的片段.免疫小鼠获得52.14%减虫率(P<0.01)和60.93%的减卵率(P<0.01),且均高于单价疫苗pVIVO2Sj23(P<0.05).结论 PCR成功扩增SjFABP-23的基因片段,血吸虫DNA多价疫苗pVIVO2SjFABP-23构建成功,该疫苗在小鼠抗血吸虫感染中具有比单价疫苗pVIVO2Sj23更好的免疫保护作用.
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日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26(Sj32)-Sj23免疫效果的观察
为了观察血吸虫病多价DNA疫苗的保护力,将小鼠分成5组:空白对照组、空质粒对照组、单价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj23组、多价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj23组.大量提取各组质粒DNA后,各组于0、3、5周在BALB/c小鼠股四头肌注射相应质粒DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率.结果显示:与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性差异(P<0.01);与单价pBK-CMV-Sj23组比较,多价DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异.提示血吸虫多价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗.
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日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3的构建及其保护性免疫研究
目的 构建日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3,用以免疫小鼠,观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用.方法 根据质粒pGEX-4T-1中SjGST-ORF和SjFABP基因序列,利用基因重组、PCR等技术将SjGST和SjFABP编码基因拼接在一起,得到融合基因SjGST-FABP,将融合基因SjGST-FABP定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA序列测定后,进行小鼠动物免疫和日本血吸虫尾蚴攻击感染及免疫保护性评价.结果 成功构建了日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3.免疫小鼠获得42.39%的减虫率和56.09%肝减卵率(P＜0.05).结论 日本血吸虫DNA多价疫苗SjGST-FABP/pcDNA3可诱导部分抗血吸虫尾蚴攻击感染的免疫保护效果,具有疫苗研究与开发价值.
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Sj31与鼠IFN-γ基因融合DNA疫苗免疫保护效果的研究
目的构建表达mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用. 方法在Sj 31基因上游引物与mIFN-γ下游引物的5'分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在mIFN-γ上游引物与Sj31基因下游引物的5'设计相同的酶切位点.分别进行PCR扩增,再通过引物的5'端相同的酶切位点进行2个PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用Sj31的上游引物和mIFN-γ下游引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体pcDNA3.0(简称为pc),构建成多价DNA疫苗pc-Sj31-mIFN-γ.对重组质粒鉴定后,大量制备纯化质粒免疫昆明小鼠,48只小鼠分为A、B、C、D 4组,对照组的小鼠于股四头肌注射质粒pcDNA3.0 100μg,3个免疫组的小鼠分别注射pc-Sj31、pc-mIFN-γ和pc-Sj31-mIFN-γ质粒DNA各100μg.在0、2、6周免疫共3次,第3次免疫后2周,每只小鼠经腹部贴片感染尾蚴40±1条,感染后第42天剖杀,计数各小鼠检获成虫数及肝卵数. 结果pc-Sj 31-mIFN-γ(D组)免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为28.56%和60.20%,但是表达鼠mIFN-γ与Sj 31抗原融合蛋白的DNA疫苗并未明显优于单纯表达日本血吸虫组织蛋白酶B(Sj31)DNA疫苗的免疫保护作用. 结论pc-Sj31-mIFN-γ多价DNA疫苗构建成功,但其诱导小鼠抗血吸虫病免疫保护效果不明显优于pc-Sj31.
