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聚乙烯亚胺修饰的白蛋白微泡转染CHO细胞实验研究
目的:制作非病毒基因转移载体,提高白蛋白微泡转基因效率.方法:采用人体白蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)和葡萄糖按一定的质量比混合后用超声振动仪声振20 s制得PEI修饰的白蛋白微泡(PAMB),通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比率以比较PEI、PEI+白蛋白、PAMB和Lipofectamine 2000的基因转移效率.结果:单纯PEI组、白蛋白+PEI组、PAMB组和Lipofectamine 2000组的平均转基因效率分别为(13.75±4.88)%、(5.20±1.15)%、(49.17±6.75)%和(53.72±5.69)%.PAMB组明显高于单纯PEI组,而与商品化Lipofectamine 2000组没有统计学差异.结论:经PEI修饰后的白蛋白微泡转基因效率明显提高,是一种有效的体外基因转移载体,本研究也可能为在体基因转移提供新的方法.
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超声介导自制白蛋白微泡和声诺维对体外报告基因转染效率的比较研究
目的:探讨超声介导微泡破裂法促进外源基因的安全转移的方法,为临床上肿瘤等疾病的基因治疗研究提供新的思路.方法:以绿色荧光蛋白基因为标记基因,以人大肠癌细胞株SW480为靶细胞,分别以自制白蛋白微泡和声诺维(SonoVue)微泡作为载体,通过超声介导微泡破裂法促进绿色荧光蛋白GFP基因在人大肠癌细胞株的定向转染,以激光共聚焦显微镜来定性和半定量观察GFP在靶细胞的表达情况,以椎虫蓝染色法检测超声作用于细胞的安全性.结果:当超声的强度为0.75W/cm2,作用时间为40 s时,对细胞比较安全;自制白蛋白微泡和声诺维微泡的浓度为10%时,分别达到佳的基因转染效率,两者无显著性差异,但后者的相对表达强度较高.结论:超声介导微泡破裂法促进外源基因的转移是一种比较安全而有效的基因转染方法.
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原发性肝癌的白蛋白靶向超声造影剂的二步法制备
目的 运用生物素-亲和素系统制备表面带有肝癌细胞膜蛋白的单克隆抗体的白蛋白微泡,并探讨其体外特异性与稳定性作用.方法 将亲和素作为微泡的原材料之一,与白蛋白按一定比例混合,声振出外壳含亲和素蛋白的超声微泡显影剂.再与已生物素化的Hab18G单克隆抗体进行偶联,并采用玻片凝集法检验抗体的活性是否正常.以高表达Hab18G蛋白的人肝癌细胞和几乎不表达Hab18G蛋白的肝星状细胞分别为对象进行花环形成实验,检验靶向微泡的特异性结合作用.结果 以此法制备的靶向微泡的玻片凝集反应呈阳性;花环实验中,可见靶向微泡沿着人肝癌细胞的轮廓呈线性排列,形成花环,而肝星状细胞表面未见明显免疫微气泡附着.结论 通过二步法,运用生物素-亲和素系统能够将抗体有效地偶联到白蛋白微气泡表面,制备出特异且稳定的靶向超声造影剂.
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超声联合微泡介导基因转染对内皮细胞骨架的影响
目的 探讨白蛋白微泡在治疗性超声条件下对介导基因转染以及对细胞骨架的影响,同时探讨超声联合微泡介导基因转染的佳声学参数.方法 六孔板培养大鼠微血管内皮细胞,一组每孔加入eGFP质粒10μg,加或不加微泡,超声条件为连续波,频率2 MHz,机械指数是0.50～1.80.照射时间是30～180 S,24～48 h后观察细胞转染情况.一组超声照射后免疫荧光染色细胞骨架,荧光显微镜观察并测定荧光强度.结果 机械指数为0.50～1.00范围内,基因转染率与机械指数呈正相关(P<0.001),再增加机械指数基因转染率差别无统计学意义.超声照射时间30～90 S范围内,基因转染率以及微管荧光强度改变与超声照射时间呈正相关(P<0.001).再延长照射时间基因转染率差别无统计学意义.同种条件下,微丝蛋白荧光强度改变无统计学意义(P>0.05).结论 超声联合微泡能够显著增加报告基因的转染率并且对细胞骨架无明显的损伤.微泡可以作为临床冠心病基因治疗的安全有效的载体.
