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钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用.方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统.采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率.采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价.结果:所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同.所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL.100和200 μgrGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0％和75.0％.rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群.结论:GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗.
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2009-2012年河北鼠型斑疹伤寒流行概况及实验室调查分析
目的 对2009-2012年河北省斑疹伤寒高发地区临床报告病例进行实验室调查分析.方法 按我国卫生部《流行性和地方性斑疹伤寒诊断标准》(WS 215-2008)在临床可疑病例高发地区设立哨点监测医院并收集病例.临床病例进行个案登记并进行发病急性期及恢复期血液标本的收集.实验室检测按WHO推荐的立克次体血清学诊断方法-间接免疫荧光法检测病人血清IgM和IgG特异抗体.以急性期血液DNA为模板,采用巢氏PCR扩增斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白基因groEL基因并测序.通过NCBI Blast平台同源比较序列并使用DNAsTAR软件进行遗传进化分析.结果 本次调查在辛集市、定州市和迁安市共收集877例临床报告病例,2009年报告病例数多(441例),迁安市病例数多(510例).急性期血清莫氏立克次体IgM抗体阳性率为72.8％(73/101),IgG阳性率为78.2％(79/101).12人通过血清IgG抗体4倍升高或降低明确诊断.PCR扩增阳性率为21.7％(22/101),成功测序的17人groEL(209 bp)基因100％同源,与其他地区序列存在较大变异,与标准株R.typhi Wilmington (AY191590)核苷酸97.0％,氨基酸只有93.9％同源,进化分析与其他菌株遗传关系较远.结论 河北省辛集、定州和迁安地区存在鼠型斑疹伤寒流行.进一步调查传播媒介及宿主对该病的预防控制具有重要公共卫生意义.加强该病临床诊断及鉴别诊断十分必要.
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2种恙虫病东方体核酸检测方法的比较
目的 探讨巢式PCR法与实时荧光PCR法在恙虫病诊断中的作用.方法 采集2010年-2014年北京市404例恙虫病疑似患者的全血样本,分别以巢式PCR法与实时荧光PCR法检测恙虫病东方体的groEL基因与47 kD蛋白基因,以血清特异性IgM检测结果为诊断恙虫病的金标准,研究2种PCR方法的灵敏度.结果 以急性期血清IgM阳性或恢复期血清IgM转阳作为确诊标准,374例患者确诊为恙虫病.其中巢式PCR法检测groEL基因阳性者323例,灵敏度为86.36％;实时荧光PCR法检测47 kD蛋白基因阳性者328例,灵敏度为87.70％.而单份急性期血清IgM抗体检测的灵敏度为87.17％.结论 实时荧光PCR法的检测时间短,适合用于快速诊断,但对于检测阴性的样本应考虑进行血清IgM或多个基因的分子生物学检测以明确诊断.
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运用限制性长度多态性和单链构象多态性技术鉴别大肠杆菌血清型
目的扩增大肠杆菌GroEL基因并通过限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,探讨进行大肠杆菌血清型鉴定的可行性.方法选择大肠杆菌GroEL基因作为鉴别的靶基因,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增,并对5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析.结果运用通用引物可以扩增出5种不同血清型大肠杆菌的GroEL基因,Pst I酶切产物的RFLP分析表明,不同血清型大肠杆菌表现出不同的RFLP图谱,SSCP分析表明,图谱变异性更大,有利于进行血清型鉴别甚至株间的鉴别.结论运用PCR-RFLP和PCR-SSCP可以进行不同血清型大肠杆菌的鉴定诊断.
关键词： groEL基因 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 单链构象多态性 大肠杆菌 -
海南省发热患者血标本中恙虫病东方体groEL基因检测
目的 了解海南省发热病人中感染恙虫病东方体的状况,并确定其基因分型.方法 利用巢氏PCR方法,检测海南省各家医院2009～2010年送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分目的片段进行基因测序,从基因水平进一步证实阳性结果,并对序列同源性及进化分析.结果 从117份发热病人血标本中发现有恙虫病东方体阳性15份,检出率为12.8％.取10份PCR阳性产物进行测序,核酸序列基本一致,彼此间仅存在3个核苷酸的差异,构建进化树进行聚类分析,结果示海南省恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体在同一分支上,同源性高.结论 海南省发热病人中存在恙虫病东方体感染的状况,应加强相关监测和防控措施,为给海南省制定恙虫病防治策略提供科学依据.
