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siRNA抑制精胺氧化酶的表达可降低人A549肺癌细胞对多胺类似物CPENSpm的敏感性
目的 研究精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)基因表达抑制对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响.方法 用siRNA技术获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR法和酶活性分析法用于鉴定SMO基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA降解分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况.结果 成功获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株.用SMO-siRNA质粒转染的细胞中,SMO mRNA和酶活性的基础水平分别降低53%和14%.用10 μmol·L~(-1) CPENSpm处理对照细胞24 h可使SMO mRNA和酶活性分别升高10倍和20倍,但在SMO-siRNA质粒转染的细胞中,这种药物对SMO的表达诱导被抑制.细胞增殖实验发现,SMO表达抑制的细胞对CPENSpm(0～20 μmol·L~(-1))的药物敏感性低于对照细胞.细胞凋亡分析发现,与对照细胞相比,CPENSpm诱导SMO表达,抑制细胞发生细胞凋亡的能力明显减弱.结论 CPENSpm诱导肿瘤细胞内SMO高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一.
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精胺氧化酶高表达对人宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的影响
目的 研究精胺氧化酶(SMO)稳定性高表达对人宫颈癌Hela细胞生长和药物敏感性的影响.方法 含SMO全长编码序列的真核表达质粒用脂质体法稳定转染人宫颈癌Hela细胞后,QT-RT-PCR和酶活性分析法筛选SMO高表达的细胞株.MTS法检测细胞的增殖和对抗癌药物的敏感性.流式细胞分析法检测细胞周期和细胞凋亡.结果 成功获得SMO稳定高表达的人Hela宫颈癌细胞株.MTS分析发现,SMO高表达细胞的生长速度显著性高于对照细胞,且对多胺类似物抗癌药物CPENSpm的敏感性明显下降.与对照细胞相比,CPENSpm诱导SMO高表达细胞发生细胞凋亡的能力明显减弱.结论 SMO稳定性高表达可降低宫颈癌细胞对抗癌药物CPENSpm的敏感性.
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抗人精胺氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备小鼠抗人精胺氧化酶(SMO)单克隆抗体(mAb),并验证其在Western blot,免疫组织化学等方法中的应用价值.方法:用pET-15b/SMO质粒转化BL2 (DE3)后,IPTG诱导表达带6×His标签的SMO重组蛋白并用Ni-NTA树脂亲和层析纯化.用SMO重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交融合,获得能高效合成和分泌抗SMO mAb的杂交瘤细胞株.所得抗体的特异性和效价用ELISA和Western blot法以及免疫组织化学技术检测.结果:成功建立了稳定分泌鼠抗人SMO的mAb杂交瘤细胞株,获得的mAb效价高、特异性强,可用于ELISA,Western blot,免疫组织化学等分析技术.结论:成功制备出高特异性并能用于多种生物分析技术的SMO mAb.
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人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备
目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.
