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焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用
目的 基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值.方法 采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征.结果 建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异.结论 本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测.
关键词： 焦磷酸测序技术 甲型H1N1流感病毒 血凝素(HA)基因 突变 裂解位点 -
焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1流感病毒基因突变中的应用
目的 基于焦磷酸测序技术建立一种快速、简单、高通量检测甲型H1N1流感病毒HA基因受体结合多突变位点的方法,以分析其基因变异的情况.方法 用狗肾传代细胞(MDCK细胞)分离病毒,用RT-PCR扩增H1N1病毒血凝素基因中的HA1片段,在生物信息学分析的基础上,针对血凝素基因含有受体结合位点的序列,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含H1N1病毒受体结合位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的受体结合位点基因特征.结果 建立了基于焦磷酸测序技术的甲型H1N1流感病毒多突变检测方法,实现甲型H1N1流感病毒HA1基因受体结合位点的高通量检测.青岛地区甲型H1N1流感病毒受体结合位点204、239氨基酸序列还没有发生变异.结论 本方法可准确、高通量、快速检测甲型H1N1流感病毒HA1基因受体结合位点突变,为甲型H1N1流感病毒的监测提供一种有效的方法.
关键词： 焦磷酸测序技术 甲型H1N1流感病毒 突变 HA1基因受体结合位点 -
焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用
结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法.从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing Technology,PSQ)进行第2 601、7 919、9 479、19 838多个碱基突变位点测序和突变频率分析.通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7 919位碱基发生了A/G突变.PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点.利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源.
关键词： 焦磷酸测序技术 严重急性呼吸综合征(SARS) 核酸多态性 点突变 -
用VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低的临床少见病原菌评价焦磷酸测序技术鉴定能力
目的：用焦磷酸测序技术鉴定经VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低或无法鉴定的46株细菌，对两种方法在少见菌的鉴定能力进行评价。方法选择经VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低或无法鉴定的46株细菌（包含革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、革兰阴性球菌及革兰阴性杆菌），提取DNA模板，做焦磷酸测序技术分析；同步进行Sanger法测序并以其结果作为准确鉴定的“金标准”。结果焦磷酸测序技术在4 h内完成46株细菌的鉴定。焦磷酸测序技术鉴定正确率为71．74%（33/46），VITEK 2 Compact系统鉴定正确率为43．48%（20/46）。46株菌中，两种方法鉴定均鉴定正确的菌株19株；焦磷酸测序技术鉴定正确、VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低、未鉴定或鉴定错误的菌株14株；VITEK 2 Compact系统鉴定正确、焦磷酸测序技术鉴定错误的菌株1株；两种方法均鉴定错误的菌株12株。结论对于微生物实验室利用传统方法无法准确鉴定的细菌，利用焦磷酸测序技术鉴定具有准确、快速及简便的特点，可适用于临床少见病原菌的鉴定。
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459例女性健康体检者HPV基因型及高危因素分析
目的：研究459例女性健康体检者宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染情况、基因型别分布及其高危因素。方法采用巢式PCR和焦磷酸测序技术检测459例受检者宫颈脱落细胞中HPV分型情况，同时收集受检者一般资料、月经婚育史、生殖道疾病既往史，分析HPV感染的相关危险因素。结果 HPV阳性检出率为17.9%，共检测出7种高危基因型别，其中HPV16检出率高（9.8%），其次是HPV58（7.0%），HPV18（5.2%）。单纯感染、双重感染、多重感染的检出率分别是9.6%、4.8%、1.5%。饮酒、经济收入＜3000元/月、性伴侣＞1个、性生活频率＞4次/月、伴有宫颈糜烂是HPV感染的危险因素（P＜0.05）。结论 HPV DNA基因型别检测可为宫颈癌的早期筛查和HPV疫苗的研发使用提供重要信息，为高危人群的早预防、早诊断、早治疗提供重要依据。
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人乳头瘤病毒16型感染及其高危因素分析
目的：检测天津市市区健康筛查女性中人乳头瘤病毒(HPV)16型感染率，分析HPV16感染的危险因素。方法通过问卷调查方式对2000例天津市市区健康普查女性进行相关因素调查，同时收集入组女性的宫颈脱落细胞。通过巢式PCR扩增和焦磷酸测序技术进行HPV型别检测，采用χ2检验和多因素Logistic回归分析HPV16感染的高危因素。结果2000例筛查标本中，HPV阳性271例（13.55%），其中前3位为HPV16型阳性占39.5%（107/271），HPV58型阳性占15.13%（41/271），HPV18型阳性占9.59%（26/271）。HPV16感染率吸烟者高于不吸烟者，首次性交年龄≤25岁者高于＞25岁者，性伴侣数≥2者高于＜2者，怀孕次数≥2者高于＜2者，流产次数≥3者高于＜3者，避孕方式为非避孕套者高于避孕套者（均P＜0.05）；HPV16感染率在不同年龄、饮酒史、教育水平、以前妇科体检等因素间差异无统计学意义。吸烟史和首次性交年龄≤25岁为HPV16感染的独立危险因素。结论天津市市区健康普查妇女HPV感染以HPV16型常见。避免高危因素的暴露，制止女性过早发生性行为，同时改变不良生活习惯是预防HPV16感染及降低宫颈癌发生的有效措施。
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焦磷酸测序技术对阿司匹林个体化用药相关SNP位点分型
阿司匹林的抗血小板作用在临床存在显著的个体差异,而rs5918、rs12041331和rs730012 3个单核苷酸多态性位点与阿司匹林的药效和不良反应有着密切的联系.本文基于PCR结合焦磷酸测序技术,建立了阿司匹林相关SNP位点的基因分型方法.自主设计扩增引物和测序引物;优化PCR扩增条件,使3个位点能够在相同的条件下扩增并通过梯度稀释基因组DNA检测方法的灵敏度;后,分别基于本文建立的新方法和Sanger测序技术对20例临床样本进行3个位点的基因分型,验证该方法的准确性.结果显示,本文成功建立了阿司匹林个体化用药相关SNP位点的基因分型方法,检测下限低至0.4 ng基因组DNA,用两种方法对20例临床样本进行3个位点的基因分型,结果完全一致,说明该方法有较高的准确性.
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焦磷酸测序技术及其应用进展
DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用普遍的DNA序列分析技术.在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中,测序反应产生的DNA片段是荧光标记的,这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离,荧光分子被激发而发光,发出的光信号被检测系统检测.Sanger法的优势在了可以分析未知DNA的序列,且单向反应的读序能力较长,目前的技术可以达到1000bp以上.在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证,而这种分析往往测几十bP就可以满足需要.在这种情况下,Sanger法未必是合适的DNA序列分析技术.新发展的焦磷酸测序技术(Pyrose-quencing)应该是目前适合这些应用的DNA序列分析技术.
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PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用
宫颈癌是严重危胁妇女生命健康的常见恶性肿瘤之一,全球每年新发病例约52.98万,死亡病例25.51万,80％发生在发展中国家[1].早期宫颈癌如能及时发现并治疗,治愈率可达90％以上.高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素,不同HPV亚型引起宫颈癌的危险性不同,其中HPV16和HPV18是致癌能力强的基因型,70％的浸润性宫颈癌与其相关[2].因此,HPV感染筛查及型别检测是预防和控制子宫颈癌的重要手段.对30 ～ 65岁已婚妇女而言,宫颈液基细胞学(ThinPrep cytology test,TCT)和HPV DNA检测的联合应用被公认为是宫颈癌筛查的佳方案[3].
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焦磷酸测序技术及其在分子生物学领域的应用
焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术.在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的.操作中不需要电泳、样品标记和染色,具有高度的可重复性、并行性和自动化特点.本文综述了焦磷酸测序技术的基本原理、测序过程和它在SNPs研究、病原微生物的快速鉴定、病因学分析、法医鉴定等方面应用.
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焦磷酸测序技术检测UGT1A3和UGT2B7在中国汉族人群中的基因多态性
目的 建立焦磷酸测序技术(pyrosequencing)研究二相代谢酶UGT1 A3和UGT2B7基因多态性在中国汉族人群中的分布.方法 应用带生物素标记扩增引物并经PCR扩增和Beads分离,制备UGT1 A3和UGT2B7焦磷酸测序单倍摸板.在PYroMarkID焦磷酸测序上进行焦磷酸测序,检测233血样的DNA标本的17个SNP位点,以确定血样DNA标本的的基因型.结果 233例血样的DNA标本中,UGTA3等位基因有9种表型,分别为UGT1A3*1*1、UGT1A3*1*2、UGT1A3*1*3、UGT1A3*1*4、UGT1A3* 1*5、UGT1A3*2*3、UGT1A3*2*4、UGT1A3*3*3和UGT1A3*3*5.UGT2B7-1和UGT2B7-2各有3种基因型,分别为G/G型、G/T型、T/T和C/C型、C/T型、T/T型.结论 我国汉族人群中UGT1A3和UGT2B7基因突变较高.
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测序技术在临床诊疗中的应用
20世纪70年代以SANGER等[1]的DNA双脱氧测序技术为代表的第1代测序平台的快速发展和成熟,为人类基因组计划提前完成立下赫赫战功,而如今以Roche公司454 GS系列的焦磷酸测序技术、以Illumina公司的Solexa Genome Analysis System的单分子阵列原位扩增测序技术,以及以ABI公司的SOLID测序仪的支持寡核苷酸链接和检测的测序技术为代表的第2代测序平台,正快速占领高端科研市场,这些测序平台成为后基因组计划相关研究中重要的工具.
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焦磷酸测序技术及其应用进展
焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术.在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的.此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点.在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用.
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线粒体DNA3243A→G异质水平定量检测方法的建立及应用
目的 针对线粒体糖尿病致病位点mtDNA 3243A→G异质性突变,建立一种快速简便、低成本,但相对准确、敏感的定量检测方法,为不同条件下选择佳检测方案提供参考.方法 收集浙江省温州市一个母系遗传性线粒体糖尿病伴耳聋家系(maternally inherited diabetes and deafness MIDD)共17人,提取外周血全基因组DNA,同时分别应用PCR-限制性片段长度多态性技术(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism PCR-RLFP)、实时荧光定量PCR结合突变阻滞形成系统(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR,RT-ARMS-qPCR)和焦磷酸测序技术检测mtDNA A3243G突变的异质水平;并以0～100％不同比例A3243G突变负荷的11个标准品为对照,3种方法同时分别检测,根据实际检测值与预期检测值的相关程度,对这三种检测方法做出可靠性比较分析.结果 PCR-RFLP、RT ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术对A3243G定量标准品的检测结果中,PCR-RFLP相对定量分析结果与预期值之间呈直线相关,决定系数R2=0.828;RT-ARMS-qPCR检测11个标准对照的突变负荷结果与预期值之间呈直线相关,决定系数R2 =0.998;焦磷酸测序技术检测结果与预期值之间呈直线相关,决定系数R2=0.997.定量检测A3243G异质水平结果PCR-RFLP介于10％～60％,RTARMS-qPCR为0到100％,焦磷酸测序技术为1％到95％;RT ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术的检测结果均接近预期值;针对MIDD家系17位成员的检测中A3243G突变携带者有13例,非A3243G突变携带者有4份,这三种方法定性检测结果一致.RT-ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术两种方法定量检测结果差异无统计学意义(t=1.140,P＞0.05).结论 针对mtDNA 3243A→G异质性突变的定量检测方法,PCR-RFLP不适合定量检测,但可作为一种临床检测方法用于人群初步筛查.对于低异质水平的A3243G突变可用RT ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术两种方法检测,但RT ARMS-qPCR相对于焦磷酸测序技术更简便、快速、可靠,成本低,是普通实验室和临床检测低异质负荷的佳选择方案.
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甲基化芯片筛选结核感染相关基因及后续验证
目的 筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因并进行验证.方法 ①纳入年龄与性别匹配的9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照,将人血中单个核细胞DNA与芯片杂交,比较结核组与健康组的甲基化差异基因,并对差异基因进行GO功能和Pathway功能分析,以及与表达芯片进行联合分析;②收集年龄与性别匹配的活动性结核与健康对照各60例,分别提取全血DNA,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因(TLR1、TLR2、TLR4)进行甲基化程度检测.结果 ①活动性结核患者与健康对照对比,大部分呈现甲基化下调状态,GO分析和Pathway分析结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、自噬、细胞因子调节及炎症反应等与结核密切相关的生物过程中;②待验证的3个基因TLR1、TLR2、TLR4包含10个CpG位点,其中TLR1基因的CpG1位点(P＜0.001)呈现高甲基化状态,TLR4基因的CpG2位点(P=0.012)呈现低甲基化状态.结论 在结核分枝杆菌感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,以低甲基化变化为主.其中TLR1基因呈现高甲基化状态,TLR4呈现低甲基化状态,提示上述基因可能在结核病的发生发展过程中具有一定的作用.
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结核感染相关差异基因的甲基化芯片筛选及验证
目的 应用甲基化芯片筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因.方法 ①甲基化芯片筛选:纳入9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照(年龄与性别均匹配),分别提取人全血单个核细胞DNA并进行亚硫酸盐转化,与Illumina HD 450K Infinium MehtylationBeadChip芯片杂交,比较3组间甲基化差异基因,进行聚类分析,检测甲基化差异片段(DMRs),对差异基因进行GO和KEGG pathway功能富集分析并与表达芯片进行联合分析,筛选结核感染相关差异基因,用于大样本验证.②大样本验证:收集活动性结核患者与健康对照各60例(年龄与性别均匹配),分别提取人全血DNA并进行亚硫酸盐转化,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因(IFNGR2、PTPN6、CRK1、ATP6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1)进行甲基化程度检测;RT-PCR方法进行上述基因mRNA表达检测.结果 活动性结核患者与健康对照相比,呈现低甲基化改变的片段占绝大部分,大部分的DMRs位于基因主体区域,其次为转录起始位点上游区域,DMRs分布少的区域为3'UTR区.GO与Pathway功能富集结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、细胞因子调节及炎症反应等与结核病密切相关的生物过程中.待后续验证的7个结核病相关甲基化差异基因IFNGR2、PTPN6、CRK-1、ATP 6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1包含32个CpG位点,其中,16个CpG位点显示出统计学差异(P＜0.05),分布于6个基因:PTPN6、WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2.发生高甲基化的基因为PTPN6,发生低甲基化的基因为WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2.SFRP1和CRK-1基因mRNA表达在活动性结核患者中显著升高.结论 在结核感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,且以低甲基化变化为主.SFRP1基因和CRK-1基因mRNA在结核组中表达上调.SFRP1和CRK-1在结核病发病过程中的作用不可忽视.
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焦磷酸测序分析短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定
目的 采用焦磷酸测序技术分析短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定并用于骨骼及腐败生物检材的检测.方法 应用blast软件,确定牙釉质蛋白基因(Amel)上1段含有3个SNP位点及1个插入/缺失(indel)位点的序列作为待测靶序列,设计引物,扩增该段序列,应用焦磷酸测序技术分析扩增序列,进行性别鉴定.对方法进行准确性、灵敏度、种属特异性的测试,并用于对骨骼和高度降解DNA的检测.结果 PCR产物分别为44bp( Amel X)和45bp( Amel Y),女性测序结果为:G/G,T/T,…/…,C/C,男性测序结果为:G/T,T/A,…/C,C/A,分型图谱清晰.应用本文方法检测100份已知性别的DNA样本,结果均正确无误,方法低DNA模板量为0.5ng,具有较好的人类种属特异性.用于高度降解DNA分析,较IdentifilerTM试剂盒具有更高的成功率且骨骼样本也得到清晰的分型结果.结论 本文采用焦磷酸测序技术分析Amel的方法在法医学性别鉴定中有较好的应用价值.
