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SELEX技术及Aptamer在小分子中的应用进展
指数富集配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)是20世纪90年代初建立的一项筛选技术.近年来,随着对其研究的不断深入和完善,此项技术逐渐成熟并应用于生物、医学等众多领域.从蛋白质等生物大分子到食品添加剂等生物小分子的检测,都得到充分应用.正因具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等众多优势,为其在出入境检验检疫食品添加剂、生物恐怖因子等检测中的应用奠定了基础.
关键词： 指数富集配基系统进化技术 适配体 小分子 出入境 检验检疫 -
基于DNA电化学生物传感技术的甘草提取液中大肠杆菌快检方法研究
该文建立了一种基于DNA电化学生物传感技术的甘草提取液中大肠杆菌测试新方法.该研究首先将硫醇基修饰的捕获探针固定在金电极上,之后核酸适配体与捕获探针杂交.当甘草提取液中存在大肠杆菌时,它与适配体结合后,信号探针又与捕获探针结合并在底物中产生电化学信号,运用差分脉冲伏安法对甘草提取液中的大肠杆菌进行测试.实验结果显示,该测定方法线性范围为2.7×102～ 2.7×108CFU·mL-1,低检出限为50 CFU·mL-1,且具有较高的特异性和较好的重现性.在实际样品甘草浸膏的测试中,该方法的测定结果与国标法的计数结果呈现较好的一致性.以上结果显示DNA电化学生物传感技术可以用于甘草提取液中大肠杆菌测试,为中药制品的快速菌检提供了新的方法.
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新型肿瘤标志物:Mu-GlcNAc
作者发现了一个新的肿瘤标志物MA153,其化学结构为Mu-GlcNAc(粘蛋白1-N-乙酰氨基葡萄糖),它可与单克隆抗体Ma695和相关Aptamer(适配体MA153-A)形成Ma695-Mu-GlcNAc-MA 153-A式的夹心反应.临床血清学检测表明,Mu-GlcNAc存在于癌症患者血中,以1U/mL为正常界值,Mu-GlcNAc的肿瘤特异度达95％,癌症检出的灵敏度对乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、结肠癌、胆管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌,分别为80％、74％、68％、70％、75％、50％、60％、55％、70％、64％、60％.本研究资料显示,Mu-GlcNAc是一个新的良好广谱肿瘤标志物.
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新型HER2适配体的筛选及鉴定
目的 研发能特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)的DNA适配体,为开发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术提供依据.方法 体外合成全长86个碱基并含有40个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以HER2表位肽为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能够选择性结合HER2多肽的核酸适配体；流式细胞术检测富集进度、适配体与HER2蛋白及HER2阳性细胞的结合特性；MFold软件预测二级结构.结果 经多轮筛选获得了能够识别HER2多肽的DNA适配体HA5,其能够选择性地结合HER2蛋白及HER2 阳性的乳腺癌细胞,而不结合胰蛋白酶和HER2阴性细胞.结论 DNA适配体HA5能选择性地识别HER2阳性的乳腺癌细胞,在研发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术方面具有应用潜能.
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针对干扰素-γ的新型核酸适配体的筛选及鉴定
目的 研发能特异性结合干扰素-γ(IFN-γ)的DNA适配体,为发展IFN-γ的新型检测技术提供基础.方法 体外合成全长为59个碱基并含有21个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以IFN-γ蛋白为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能够选择性结合IFN-γ蛋白的核酸适配体；流式细胞术检测富集进度、适配体与IFN-γ蛋白结合特性；MFold软件预测二级结构.结果 经多轮筛选获得了能够识别IFN-γ蛋白的DNA适配体B3-8,其能够选择性地结合IFN-γ蛋白,而与血清白蛋白的结合较弱.经检测其Kd值为185 nmol/L.结论 DNA适配体B3-8能选择性地识别IFN-γ蛋白,在研发针对IFN-γ的新型检测技术方面具有应用潜能.
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急性髓系白血病CD33+/CD34+细胞表面核酸适配体的筛选及结构分析
目前,对急性白血病细胞表面特异性分子标记物所知甚少,因而白血病的诊断尚缺乏白血病细胞的特异性方法.为此,本研究采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponenti enrichment,cSELEX)技术,筛选与急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)M2型(AML-M2)患者CD33+/CD34+细胞结合的核酸适配体(aptamer),为寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物提供基础.首先,通过免疫磁珠方法分选出AML-M2患者骨髓CD33+/CD34+细胞并将其作为靶细胞,正常人CD33+/CD34+细胞为反筛选细胞,采用cSELEX技术,从单链DNA(single strand deoxyfibonucleic acid,ssDNA)文库中筛选与AML-M2CD33+/CD34+细胞结合的适配体.随后,通过克隆和测序分析各适配体的结构.结果显示,经过13轮次的反复筛选,ssDNA文库的适配体与AML-M2患者CD33+/CD34+细胞的富集度从0.7%增加到52.9%,至第13轮时趋于稳定.对所获得的30个适配体序列分析表明,大多数适配体含有CCCCT、CTCTC和CTCAC保守序列中的一种.二级结构分析显示,30个适配体中含有3种不同类型的模拟二级结构.结论:本研究成功筛选到AML-M2型白血病CD33+/CD34+细胞的适配体,这为进一步寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物以及AML-M2型白血病的分子诊断创造了基础.
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铜绿假单胞菌表面脂多糖适配体的筛选及其抑制巨噬细胞极化的研究
目的 筛选与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)表面脂多糖( LPS)特异性结合的适配体,探讨其抑制巨噬细胞极化的效果.方法 提取PA的LPS成分,通过指数富集的配基系统进化技术 ( SELEX)筛选与其特异性结合的高亲和力 DNA 适配体,利用酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)、定量PCR(Q-PCR)等方法探讨其对巨噬细胞极化的影响.结果 本研究筛选出能与PA-LPS特异性结合的适配体PL-6,并发现其能够阻断PA-LPS与相应受体TLR4的结合,抑制巨噬细胞M1型过度极化,维持巨噬细胞稳态.结论 本研究筛选出可与PA-LPS特异性结合的高亲和力适配体,为PA可能引起脓毒症的预防和治疗提供了新的策略.
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识别多种种属来源间充质干细胞核酸适配体的筛选及鉴定
目的 筛选能识别多种属来源的间充质干细胞(MSC)的核酸适配体,并对其进行鉴定.方法 从幼兔股骨骨片分离MSC并进行成骨、成脂诱导分化鉴定.以分离得到的兔源性MSC为筛选靶标,利用细胞SELEX 技术筛选核酸适配体.将第5轮富集文库进行克隆、测序,利用RNA structure、MEME软件分析获得候选序列,利用流式细胞仪鉴定候选适配体与兔、大鼠、人源性MSC的结合.结果 从兔股骨骨片分离得到的MSC可诱导向成骨、成脂分化.经过5轮SELEX筛选获得兔MSC富集文库.候选适配体5-1-12不仅结合兔MSC,也识别大鼠和人源性MSC.结论 活细胞SELEX筛选获得与多种属来源MSC结合的核酸适配体5-1-12.
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适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展
核酸适配体是一类能特异性地靶向特定抗原的单链寡聚核苷酸。较之常用的抗体等靶头向性配体，适配体体积相对较小、免疫原性较低且易于体外筛选。目前，以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统通常有3类：第1类将适配体修饰于脂质体、纳米粒、胶束等纳米载体上，形成适配体靶向的纳米载体；第2类直接将适配体与药物/荧光物质相连，形成适配体-药物/荧光物质共轭物；第3类将适配体自身作为药物的靶向载体。本文就近期以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展进行概述。
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毛细管电泳技术在核酸分析中的应用
毛细管电泳技术以其高效、快速、所需样品少等特点而广泛应用于核酸的分析.本文综述了近5年来毛细管电泳技术在核酸定性、定量和筛选研究中的应用,包括反义寡核苷酸的分析,适配体的筛选,基因突变的分析,此外对微芯片毛细管电泳技术及其在核酸分析研究中的应用进行了介绍,并对其前景进行了展望.
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基于全菌消减SELEX技术的体外筛选大肠埃希菌O157∶H7适配体研究
目的 筛选出能特异性识别大肠埃希菌O157∶H7的单链DNA(ssDNA)适配体并进行鉴定.方法 利用全菌消减SELEX技术,以完整菌体为靶标菌和消减菌,通过体外筛选方法筛选出大肠埃希菌O157∶H7特异性ssDNA适配体.利用荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜、克隆测序、Chromas和DNAMAN分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行特异性鉴定.结果 经过7轮全菌消减SELEX筛选,荧光分光光度计检测结果鉴定第六轮文库富集达到饱和;通过测序分析、荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜特异性检测,获得1条与大肠埃希菌O157∶H7特异性结合的适配体Aptamer1.结论 利用全菌消诚SELEX技术成功筛选获得大肠埃希菌O157∶H7特异性ssDNA适配体.
关键词： 大肠埃希菌O157∶H7 适配体 全菌消减SELEX技术 特异性 -
适配体光子晶体传感材料的制备及初步应用
目的 制备高度有序稳定的反蛋白石光子晶体材料,并将其应用于黄曲霉毒素B1的快速检测.方法 以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球为模板,基于溶液中胶体/模板共组装法制备SiO2反蛋白石光子晶体材料.以黄曲霉毒素B1(AFB1)为靶标,以适配体作为识别元件,制备适配体光子晶体传感材料,采用间接竞争法,建立黄曲霉毒素B1的快速检测方法.结果 该方法可控合成大面积高度有序的三维结构材料,并进一步制备了适配体光子晶体传感材料,初步实现了黄曲霉毒素B1的快速检测,低检测限达10-3ng/ml.结论 该方法可防止硅溶胶过度覆盖和非均匀渗透,减少了随机缺陷,简化了制备步骤.此外,还可修饰某些官能团制备成传感检测材料,如修饰氨基后,可通过戊二醛连接适配体、蛋白、抗体以及受体等,极大地拓展了光子晶体的应用领域.
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适配体上转换发光生物传感技术在食品安全快速检测中的应用
食品安全快速检测技术在预防医学领域扮演着至关重要的角色.传统理化检测方法存在耗费大、操作难、检测环境要求高等问题,不能满足质量安全监督中快速现场筛查的需求,正逐步被新兴的快速检测传感技术代替.新型适配体上转换发光生物传感技术建立在功能化上转换发光纳米材料与适配体技术相结合基础上,是一种新兴快速检测技术.与传统免疫荧光技术相比,其灵敏度高、特异性好、稳定性强,广泛应用于快速检测中.对上转换发光技术及适配体技术进行了简要介绍,对基于适配体的上转换发光生物传感技术及其在食品安全检测领域的应用进行了综述;根据目前的应用领域,指出了该技术存在的瓶颈及未来的发展趋势,为该技术在食品安全及多领域的应用提供了参考.
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SELEX技术的靶标范围拓展
靶标范围的不断拓展是指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术和其他随机文库技术(如噬菌体表面展示技术等)的显著特征之一.经过20多年的发展,SELEX的靶标已经拓展到包括金属离子、各种有机小分子、药物、蛋白质等生物大分子、致病微生物、活细胞和组织等在内的多种形式,以细胞和组织为靶标的SELEX筛选策略在肿瘤靶向诊断和治疗的研究中也得到了初步应用,本文综述了SELEX技术的靶标拓展情况.
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SELEX技术中分离方法的研究进展
指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment,SELEX)技术是一种用特定的随机寡核苷酸文库,并结合体外PCR扩增,经过多轮筛选,筛选出能与靶分子高亲和、高特异性结合的寡核苷酸序列[该序列被称为适配体(aptamer)]的技术.适配体类似于抗体,但优于抗体,有可能代替抗体应用于临床诊断和疾病的治疗.SELEX技术问世20年来,适配体的应用前景吸引着众多研究者不断探索,其应用领域得到不断拓展.SELEX有两个技术关键步骤:(1)将结合或未结合靶分子的寡核苷酸序列分离;(2)用PCR扩增与靶分子结合的寡核苷酸.本文主要就SELEX分离方法作一综述.
关键词： 指数富集配体进化技术 适配体 随机寡核苷酸文库 -
适配体芯片技术及其应用
适配体(aptamers)是通过指数级富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选而获得的某种单链DNA或RNA分子[1],这些分子能够折叠成特定的三维空间结构与其所针对的各种靶物质特异地结合,而不是依赖特异性的碱基排列.适配体芯片又称适配体微阵列,是继基因芯片、蛋白质芯片之后发展起来的一种新芯片.
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骨质疏松症治疗新途径:适配体靶向投递药物逆转老年性骨丢失
骨质疏松症是一种由于骨形成及骨吸收失衡所造成的一种代谢性骨病,与年龄密切相关.随着老龄化社会的来临,骨质疏松症发病率逐年升高.适配体作为骨质疏松症新的靶向治疗剂,具有低免疫原性、高产量、低成本和高稳定性等优点,可连接小分子靶向骨,成为骨质疏松症治疗的新途径.
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氧化石墨烯与核酸适配体在检测方面应用的进展
核酸适配体是一类能与靶物质高亲和力和特异性结合的寡核苷酸链，氧化石墨烯是一种具有多种独特理化性质的新兴材料，近年来它逐渐应用到了核酸适配体领域并取得了一系列进展。本文综述了近年来氧化石墨烯与核酸适配体针对小分子及金属离子、生物大分子和细胞等不同靶物质的检测方面的应用进展，以期为氧化石墨烯在适配体检测领域的大规模应用提供参考。
关键词： 适配体 氧化石墨烯 检测 指数富集的配体系统进化技术 适配体传感器 -
生物膜干涉法研究STX与适配体间的相互作用
目的 研究石房蛤毒素与其适配体间的相互作用.方法 采用生物膜干涉法测定石房蛤毒素与适配体间的亲和常数,结合常数及解离常数,以其类似物河豚毒素和随机序列分析该适配体的特异性.结果 该适配体可以与石房蛤毒素结合,Kd值为7.44 μM,且不与河豚毒素结合.随机序列以较低的亲和力与石房蛤毒素结合.结论 该适配体可以进行进一步优化,提高其与石房蛤毒素的亲和力与稳定性,以用于石房蛤毒素的检测,并用于石房蛤毒素的中毒治疗.
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肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及其亲和力和特异性的鉴定
目的:采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得一组已知和未知肝癌血清肿瘤标志物的适配体,为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.方法:收集50例首次经诊断证实为原发性肝癌的患者血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体.先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD 18-T载体连接进行转化、挑选单克隆送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值).结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个.特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91％以上.结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与肝癌患者血清特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗肝癌血清的能力,有可能为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.
