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基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-OC43冠状病毒
目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸.方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(GenBank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45 min.在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以终反应颜色变化作为结果判断标准.对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性.结果 通过引物筛选终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性.与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的.结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力.
关键词： 人冠状病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 -
RT-LAMP快速检测Norwalk病毒GⅡ型
建立一种检测Norwalk病毒GⅡ型快速、敏感的一步逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription-loop-me-diated isothermal amplification,RT-LAMP)方法.针对Norwalk病毒RNA聚合酶基冈特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,65℃保温约120 min,完成对Norwalk病毒GⅡ的扩增,扩增产物通过肉眼观察、SYBR GreenⅠ染色、凝胶电泳及酶切消化进行鉴定.利用RT-LAMP和RT-PCR方法同时检测48份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本来验证RT-LAMP方法的特异性;将Norwalk病毒GⅠⅡ RNA一系列稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感性.46份Norwalk病毒GⅠⅡ粪便标本出现LAMP扩增反应:通过肉眼观察、SYBR Green Ⅰ染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,LAMP产物的特异性通过酶切消化加以证实;2份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本未出现RT-LAMP扩增.RT-LAMP与RT-PCR特异性符合率为100%,RT-LAMP和RT-PCR检测Norwalk病毒GⅡ的检测下限均为15.6pg/管.与RT-PCR相比较,一步RT-LAMP法检测粪便中Norwalk病毒GⅡ的方法是一种快速、敏感、特异且准确的方法,有望用于快速检测感染性腹泻暴发时粪便中的Norwalk病毒GⅡ.
关键词： 逆转录环介导等温扩增 Norwalk病毒GⅡ RNA聚合酶 检测 -
基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增技术检测GⅡ型诺如病毒基因
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法应用于GⅡ型诺如病毒基因检测.针对诺如病毒RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白基因序列(RNA-dependant RNA polymerase and eapsid protein gene)设计出6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行扩增反应60min.在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,以其颜色变化作为结果判断标准,并经琼脂糖凝胶电泳验证.本文利用此技术对不同腹泻病毒进行了特异性分析,对体外转录的GⅡ型诺如病毒RNA的梯度稀释进行了灵敏度分析,同时与逆转录PCR (RT-PCR)方法进行比较,并对93份腹泻患者粪便中的病毒核酸进行了检测.结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,灵敏度达到1 000拷贝/μLRNA分子水平,与常规检测RT-PCR方法相当.对临床标本的阳性检出率也与常规RT-PCR相当.由于此方法特异性强,灵敏度较高,耗时短,结果直观,因此有望用于GⅡ型诺如病毒的现场快速检测.
关键词： 逆转录环介导等温扩增 GⅡ型诺如病毒 -
利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型
为直接根据颜色变化进行可视化检测H1亚型、N1亚型、N2亚型禽流感病毒(AIV),根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立针对H1亚型AIV及特异性鉴定N1、N2亚型的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据GenBank中的AIV基因序列,设计了三套分别针对H1亚型AIV-HA基因及N1、N2亚型AIV-NA基因的特异性简并引物,并优化反应条件和体系.结果表明建立的检测方法对其它亚型AIV及禽呼吸道病原体无交叉扩增反应并能特异性地检测N1、N2亚型AIV,灵敏度优于传统的RT-PCR方法.整个反应在常规水浴中50min就可完成,反应结束后不需打开反应管盖,可根据反应液的颜色变化对结果直接进行判定.120份临床样品用建立的RT-LAMP方法检测到14份H1N1亚型AIV、8份H1N2亚型AIV,结果与病毒分离结果相符.本研究建立的三种RT-LAMP可视化检测技术特异、灵敏、快速、操作和结果判定简便,适合在基层进行H1亚型AIV的快速检测及N1、N2亚型AIV的分型.
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寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用
本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性.建立的可视化RT-LAMP方法可检测的低浓度为101 copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应.该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据.
关键词： 寨卡病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 羟基萘酚蓝 -
应用简便的逆转录环介导等温扩增方法检测风疹病毒核酸
目的 应用简便快速的核酸检测新方法-逆转录环介导等温扩增方法(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)检测风疹病毒核酸,并与逆转录-聚合酶链反应(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法进行比较.方法 比较RT-LAMP方法与RT-PCR方法,检测吉林省风疹病毒分离株病毒核酸的检出率.结果 对20份风疹标本分离病毒后,应用上述两种方法检测风疹病毒核酸,结果完全相同,阳性率均为55%(11/20),一致性达100%.结论 两种方法检测结果相同,但RT-LAMP比RT-PCR更简便,快速.
关键词： 风疹病毒 逆转录环介导等温扩增 核酸检测 -
克里米亚-刚果出血热病毒可视化逆转录环介导等温扩增快速检测法的建立
目的 建立克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)的可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP)快速检测法.方法 体外合成CCHFV的S基因,构建重组质粒,体外转录为模板RNA,在线设计3组LAMP引物,使用实时浊度仪筛选出佳引物,以羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)作为指示剂,建立可视化RT-LAMP反应体系.结果 实时浊度检测结果显示合成的3组LAMP引物中第1组引物的扩增效率高,峰值出现于20 min.添加环引物后,扩增效率进一步提高,13 min即可达到峰值.利用佳引物建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法低检测限浓度为10拷贝/μl,检出时间为30 min,较巢式RT-PCR法和实时定量RT-PCR法分别高1-3个数量级.该方法稳定性好,不会与症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒(汉滩型和汉城型)、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)产生交叉反应.结论 建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法,灵敏度好、特异度高、快速廉价、操作简单,无需开盖即可直接观察结果,适用于条件有限的基层单位和偏远地区.但仍需临床样本进行进一步验证.
关键词： 克里米亚-刚果出血热 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 -
逆转录环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒基因
目的 建立检测H7N9禽流感病毒基因的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription Loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法,并初步评估应用.方法 设计、合成H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因的引物组,通过优化参数,建立RT-LAMP反应体系,使用梯度稀释的标准品测试该体系检测灵敏度,并使用对比毒株测试特异性,再对142份临床标本进行实样检测.结果 成功建立了检测H7N9禽流感病毒HA基因、NA基因的RT-LAMP方法,可直接肉眼观察判读结果,检测其HA基因、NA基因的敏感性分别达到10拷贝每反应、5拷贝每反应,对其他常见呼吸道病原无交叉反应;在测序证实阳性的临床样本中,对于病毒HA基因、NA基因检出率分别为100％、92.68％.结论 逆转录环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒基因,具有简单、快速、灵敏度高,检测结果可视化,无需特殊设备等优点,在禽流感病原监测上有一定应用前景.
关键词： H7N9禽流感病毒 逆转录环介导等温扩增 检测 -
逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用
目的 建立逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测诺如病毒的方法 .方法 采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增诺如克病毒特异性基因,并与RT-PCR方法 比较.结果 与RT-PCR技术相比,RT-LAMP法更加简便快速,能够在等温条件下进行,特异性好,具有更高的灵敏性.结论 RT-LAMP方法 具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测诺如病毒快速简便的新方法 .
关键词： 诺如病毒 逆转录环介导等温扩增 基因检测 -
可视化诺如病毒G Ⅱ型RT-LAMP方法在感染性腹泻疫情中的应用研究
目的 探讨可视化诺如病毒(norovirus,NoV)G Ⅱ型逆转录环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法在感染性腹泻疫情中的应用价值.方法 利用文献报道的可视化NoV G Ⅱ RT-LAMP检测方法和RT-PCR方法分别对151份感染性腹泻疫情相关标本(80份病例粪便、43份肛拭子、16份末稍水和12份桶装水)标本进行NoV检测;评价RT-LAMP法和RT-PCR方法的一致性.结果 RT-LAMP方法检出42份感染性腹泻疫情标本NoV G Ⅱ型RNA阳性,阳性率为27.81％;RT-PCR方法检出37份感染性腹泻疫情标本NoV G ⅡRNA阳性,阳性率为24.50％;2种方法的检测结果经统计学分析,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 可视化NoV G ⅡRT-LAMP方法可用于感染性腹泻疫情的NoV GⅡRNA筛查.
关键词： 逆转录环介导等温扩增 NoV G Ⅱ 检测 -
RT-LAMP方法在血液HCV筛检中的初步应用
目的 探讨逆转录环介导等温扩增(revere transcription loop - mediated isothermal amplification,RT- LAMP)方法在血液丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)筛检中的应用价值.方法 利用RT- LAMP法和ELISA法分别对450份血液标本进行HCV检测.结果 RT- LAMP方法检出3份HCV RNA阳性,加荧光染料(SYBR GreenI)染色后进行结果判定;ELISA法检出2份抗HCV阳性标本;RT - LAMP法相比ELISA法检出率更高.结论 RT- LAMP法有应用于血液筛检HCVRNA的潜力.
关键词： 丙型肝炎 逆转录环介导等温扩增 血液筛检
