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转录因子c-Ets-2 shRNA构建和对细胞促凝活性的影响
目的:构建转录因子c-Ets-2的短发夹状双链RNA (shRNA)干扰质粒,验证其对转录因子c-Ets-2表达的干扰效果,并研究转录因子c-Ets-2对人凝血酶原酶(hfgl2)基因表达及细胞促凝活性的影响.方法:采用基因克隆方法构建c-Ets-2 shRNA干扰质粒,并使用酶切鉴定方法和测序进行证实.使用实时荧光定量逆转录PCR (qRTPCR)和Western blot方法对干扰效果进行验证.并进一步采用该质粒与HBV病毒蛋白表达质粒共转染单核细胞系THP-1,研究c-Ets-2 shRNA干扰质粒对hfgl2基因转录表达的影响和对细胞促凝活性的作用.结果:c-Ets-2 shRNA干扰质粒构建成功,可下调转录因子c-Ets-2 mRNA和蛋白水平的表达.当与HBx病毒蛋白表达质粒共转染时,该干扰质粒可抑制hfgl2基因的转录,降低细胞的促凝活性.结论:转录因子c-Ets-2与凝血级联途径有关,参与了重型肝炎和肝细胞癌等疾病的发生发展.
关键词： 基因调控 转录因子c-Ets-2 短发夹状双链核糖核酸干扰 促凝活性 -
体外循环中炎症因子释放对单核细胞促凝活性的影响
目的 探讨体外循环(CPB)诱导的炎症因子释放对单核细胞促凝活性(PCA)的影响.方法 观察人重组白细胞介素-6(rhIL-6)对培养的人外周血单核细胞(PBMCs)和U937细胞PCA的诱导作用,及PBMCs在rhIL-6不同剂量和不同时点作用下PCA的变化.结果 rhIL-6能显著增加PBMCs和U937细胞的PCA(P＜0.01);rhIL-6诱导PBMCs的PCA增加表现出明确的量效和时效关系,在IL-6 100 ng/L培养4 h后,PBMCs的PCA较对照组增加6.7倍;组织因子(TF)单克隆抗体(MoAb)能有效抑制rhIL-6对PBMCs和U937细胞的诱导作用,并呈现为剂量依赖性的关系,当TFMoAb浓度为10μg/L时,PBMCs和U937细胞PCA与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CPB导致的IL-6释放能诱导培养的PBMCs的PCA提高,而这种作用与TF的表达增加有关,并能被TFMoAb有效抑制.
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人fg12凝血酶原酶FRED结构域的原核表达、纯化及其凝血活性的鉴定
目的 建立人fg12凝血酶原酶纤维蛋白原相关结构域(fibrinogen-related domain,FRED)的原核表达系统,并鉴定表达蛋白的凝血活性.方法 应用RT-PCR从外周血单个核细胞扩增fg12凝血酶原酶FRED基因,克隆到原核表达载体pET22b(+),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达,重组蛋白经SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定并用His-Tag柱纯化,以促凝活性(procoagulant activity,PCA)检测鉴定其凝血功能.结果 扩增了人fg12凝血酶原酶FRED基因,成功构建了重组pET-FRED原核表达质粒,表达的融合蛋白具有直接促凝血活性.结论 建立了人fg12凝血酶原酶FRED的高效原核表达系统,FRED可能为fg12凝血酶原酶促凝血的活性区域.
关键词： 凝血酶原酶 fg12 纤维蛋白原相关结构域 原核表达 促凝活性 -
炎症及促凝活性指标在2型糖尿病动脉粥样硬化中的意义
目的 观察血浆炎症及促凝活性相关指标的水平变化在2型糖尿病动脉粥样硬化患者诊治评价中的意义.方法 采用免疫比浊法、酶联免疫吸附双抗体夹心法和血凝分析仪,分别检测单纯糖尿病组60例、糖尿病合并大血管病变组74例和正常对照组46例血浆hsCRP、PAI-1、t-PA和Fbg浓度. 结果 2型糖尿病血管病变组的hsCRP、PAI-1和Fbg水平均高于无血管病变组和正常对照组(P＜0.05,P＜0.01),但t-PA在各组间差异无显著性.结论 hsCRP、PAI-1和Fbg等水平的升高,可能与2型糖尿病动脉粥样硬化和血栓形成有关.
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恶性肿瘤的静脉血栓形成
自1872年Troussean首次提出癌症患者易发生静脉血栓的观点[1];1879年Billroth首先发现肿瘤细胞存在于血栓中之后,陆续的研究报道表明,多数恶性肿瘤患者存在有血液的高凝状态或静脉血栓;肿瘤的促凝活性不仅仅是一种表现恶性的现象,而且是引发癌细胞扩散的一个组成部分.据统计,尸解发现50%的癌患者有血栓形成[2];恶性肿瘤合并血栓的发生率10-15%,而其中15%左右的血栓形成先于癌的诊断[3].约有超过1/3的健康人出现各部位的深静脉血栓后,终证明是恶性肿瘤所引起.因此对于这种肿瘤相关性血管病变的识别和警惕,有助于肿瘤的早期诊断和治疗.
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丹参酮ⅡA对NB4诱导的人脐静脉内皮细胞促凝活性的影响
目的 探寻丹参酮ⅡA(TanⅡA)对于急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)促凝活性(PCA)的影响.方法 将TanⅡA作用24、72、120 h的NB4细胞条件培养基(NB4-CM)或不同浓度TanⅡA与其对应的120 h NB4-CM共同作用HUVEC,并以ATRA、DMSO和RMPll640作为阳性、阴性和空白对照,收集HUVEC裂解液采用一期凝血法测定其PCA,采用改良发色底物法测定组织因子活性(TF:act).结果 ①TanⅡA作用72、120 h的NB4-CM有一定的升高内皮细胞PCA的作用,以120 hNB4-CM作用强,作用6 h明显,1.0 μg/mL的TanII A与0.3 μg/mL ATRA作用相当.②5.0 pg/mL的Tan ⅡA能明显降低其NB4-CM诱导的内皮细胞PCA,与0.3/μg/mL ATRA的差异无统计学意义.<5.0 μg/mL浓度的TanII A无此作用.③TanⅡA-120 h-NB4-CM和ATRA 120 hoNB4-CM均能升高HUVEC的TF:act,6h达峰值,且两者间无差异.TanⅡA 120 h-NB4-CM所诱导的HUVEC的TF:act 12h轻微降低,24 h回复到基础水平,而ATRA 120 h-NB4-CM所诱导的TF:act在6h达峰后,12h即明显下降,24 h亦降至基础水平.④加入1.0μg/mL TanⅡA后.内皮细胞TF活性在各时间点与未加药组无明显差异,而0.3/μg/mL ATRA在6 h可显著抑制其NB4-CM所诱导的内皮细胞TF活性升高,之后各个时间点无明显差异.结论 TanⅡ A在诱导NB4细胞分化过程中的条件培养基能升高人脐静脉内皮细胞PCA和TF活性,加入适当浓度的TanⅡA可降低这种作用;这些作用与ATRA作用相当.
关键词： 丹参酮ⅡA急性早幼粒细胞白血病 人脐静脉内皮细胞 促凝活性 NB4细胞 组织因子 -
丹参酮ⅡA对NB4所诱导的人ECV304细胞株促凝活性的影响
目的研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4诱导的人ECV304细胞株促凝活性的影响.方法①分别用0.5 μg/mL Tan ⅡA、0.3μg/mL ATRA、0.1 g/L DMSO、RPMI1640处理培养NB4细胞制成条件培养基TanⅡA-NB4-CM,ATRA-NB4-CM、DMSO-NB4-CM以及RPMI1640-NB4-CM,再分别与ECV304细胞在37℃共同孵育0、4、8、12 h,利用复钙时间测定及改良发色底物法,分别测定ECV304细胞裂解液的肿瘤促凝活性(PCA)和组织因子活力(TF:Act).②ECV304细胞分别与0.5 μg/mL Tan ⅡA及TanⅡA-NB4-CM在37℃共同孵育4、12、24、72、120 h,用上述同样方法测定ECV304细胞裂解液的PCA和TF.Act.结果①0.5μg/mL Tan ⅡA处理NB4细胞24、72、120 h的条件培养基能使ECV304细胞PCA增强,ATRA具有相似作用(P＞0.05).②0.5μg/mL的Tan ⅡA对0.5μg/mL Tan ⅡA作用NB4 120 h的条件培养基(Tan ⅡA-120 h-NB4-CM)促ECV304细胞PCA有抑制作用,其作用强度呈时间依赖性,120 h达到高峰,再增加TanⅡA浓度,作用强度不增加;与0.3μg/mL ATRA作用相似.③Tan ⅡA-120 h-NB4-CM能够增加ECV304细胞TF:Act,并随作用时间增加而增强,TanⅡA与ATRA作用相似(P＞0.05).④0.5μg/mL Tan ⅡA能够抑制Tan ⅡA-120 h-NB4-CM对ECV304细胞的TF:Act,并随作用时间增加而增强,ATRA具有相似作用(P＞0.05).结论Tan ⅡA在诱导NB4细胞分化凋亡的同时,可能通过某种因子增强NB4细胞对ECV304细胞促凝活性和组织因子活力;TanⅡA能够有效阻止NB4细胞增强ECV304细胞的促凝活性和组织因子活力,起到保护细胞的作用.
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丹参酮ⅡA对NB4细胞促凝活性的影响
目的研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞促凝活性(PCA)的影响.方法使用Tan Ⅱ A处理NB4细胞,复钙时间检测NB4细胞的PCA,并用发色底物法测量反应体系中因子Xa(FXa)水平,ATRA处理的NB4细胞作为阳性对照组.结果 Tan Ⅱ A 可下调NB4细胞PCA水平,与空白对照组之间有统计学差异(P<0.01);Tan Ⅱ A和ATRA下调NB4细胞的PCA水平相似,无统计学差异(P>0.05);经Tan Ⅱ A作用的NB4细胞,FXa水平降低.结论 Tan Ⅱ A与ATRA相似,均可降低NB4细胞的PCA水平,其降低PCA作用是通过下调NB4细胞TF的表达实现的.
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丹参酮ⅡA对NB4所诱导的ECV304细胞促凝活性影响的机制探讨
目的:研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞诱导的血管内皮细胞株(ECV304)促凝活性(PCA)的影响,并对其机制作初步探讨.方法:(1)分别用1.0μg/mL TanⅡA、0.3μg/mLATRA、0.01%DMSO、PRMI1640处理NB4细胞24、48和72h,取其上清液作为条件培养基(hNB4-CM).将这些CM分别与ECV304细胞在37oC共同孵育0、4、8和12h,用反复冻融法制备ECV304细胞裂解液,采用一期凝血法测定其PCA;采用ELISA法测定条件培养基中的TNF-α .(2)ECV304细胞与1.0μg/mL TanⅡA及TanⅡA 72h-NB4-CM 在37oC共同分别孵育6、12、24和48h,并以ATRA和DMSO分别作为阳性和阴性对照,用上述相同方法测定ECV304细胞裂解液的PCA.结果:(1)1.0 μg/mL Tan ⅡA可以诱导NB4细胞分化,其作用NB4细胞的培养基有一定的升高ECV304细胞PCA的作用,该作用在孵育4h时达高峰,之后ECV304细胞PCA逐渐下降.与0.3μg/mL ATRA的作用无统计学差异(P>0.05).(2)1.0 μg/mL的TanⅡA对TanⅡA-72h-NB4-CM促ECV304细胞PCA有抑制作用,其强度随作用时间增加而增加,与1.0μmol/L ATRA比较,P>0.05.(3)TanⅡA作用NB4细胞的培养基中TNF-α浓度,在作用前7h内随作用时间增加而增加,与0.3μg/mL ATRA比较无差异(P>0.05).结论:Tan ⅡA能诱导NB4细胞分化,后者在分化过程中释放的TNF-α可能与ECV304细胞PCA活性升高有关;Tan ⅡA又能抑制Tan ⅡA-NB4-CM增强ECV304细胞PCA的作用.
