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多重PCR技术检测医院感染大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因型别
目的了解我地区大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌携带质粒介导AmpC酶的情况及基因型别. 方法用头孢西丁耐药表型筛选阳性可疑菌株,提取耐药质粒,然后采用多重PCR技术检测是否存在质粒介导的AmpC 基因及其基因型别;并对PCR产物进行测序. 结果 7株头孢西丁耐药的大肠埃希菌多重PCR均为阴性,4株肺炎克雷伯菌中3株多重PCR阳性,测序结果均为DHA-1型质粒AmpC酶. 结论多重PCR技术是一种灵敏、特异、快速的检测质粒AmpC酶及其基因型别的好方法;采用该方法在我地区首次检测出产DHA-1型质粒AmpC酶的肺炎克雷伯菌.
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下呼吸道标本MRSA耐药性及其SCCmec基因分型的研究
D型1株.结论 医院MRSA均未检测到PVL阳性株,SCCmec基因型以Ⅲ型为主,部分为SCCmecⅡ型,ICU、结核5科有MRSA暴发流行,主要流行株为A1亚型、A3亚型;这些MRSA菌株具有多药耐药的特征,应引起临床医师及感染控制部门高度重视.
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嗜麦芽寡养单胞菌中Ⅱ类整合酶基因的发现及意义
目的 检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在嗜麦芽寡养单胞菌临床分离株中存在情况,分析整合子对细菌耐药性的影响.方法 应用多重PCR方法筛选嗜麦芽寡养单胞菌整合酶基因.结果 Ⅰ类整合子的检出率为13.4%,其中3株菌同时带有Ⅰ类和Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合子的阳性率为3.6%,未检测到Ⅲ类整合子.结论 嗜麦芽寡养单胞菌中主要分布Ⅰ类整合子,首次发现嗜麦芽寡养单胞菌中含有Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合酶基因可能增加细菌多药耐药的发生.
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产KPC与NDM碳青霉烯酶细菌多重PCR方法的构建与临床应用研究
目的 建立一种适于临床微生物实验室快速检测blaKPC与blaNDM基因的多重PCR方法.方法 根据Gene Bank提供的序列,人工合成blaKPC与blaNDM基因模板以及多重PCR反应的引物；利用产KPC的大肠埃希菌作为阳性对照,对新构建的多重PCR反应进行验证,并且对临床15例临床分离鉴定的疑似产KPC与NDM的耐药细菌进行检测.结果 成功构建了用于检测blaKPC与blaNDM基因的多种PCR反应体系,可以筛查出产KPC的大肠埃希菌；检测的15株临床分离鉴定的细菌均为阴性.结论 构建的多重PCR反应体系可以快速准确地对临床产KPC与NDM细菌进行检测,以用于临床疑似细菌的进一步确认.
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分子生物学技术在病原菌耐药检测中的应用进展
在应用抗菌药物治疗被病原菌感染的患者时,临床患者对药物是否敏感是治疗的关键,尤其是病原菌对≥1种药物耐药的出现,使药物敏感性的鉴定在临床治疗中有着重要的地位.在药物敏感试验操作和结果判断标准化的基础上,如果能知道病原菌是否携带有耐药基因,那更能高度预测药物治疗的效果.但是,耐药基因的存在并不一定导致药物治疗的失败,因为这与它表达水平的高低有关[1,2],但我们可以以此来监测和预测临床用药.
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多种呼吸道病原微生物快速筛查技术的建立
目的 解决临床急性呼吸道感染病原微生物快速筛查诊断的难题,建立一种能同时快速检测多种病原体的有效方法.方法 采用多重PCR与Luminex xMAP多重分析技术平台相结合,以荧光微球为检测载体,建立快速、多重检测DNA或RNA技术平台.结果 经14种(18个亚型)常见呼吸道病原微生物标准株检测,在反应体系中多重PCR产物只与相应的病原菌检测微球杂交,无非特异性反应;通过138例临床标本检测验证,肺炎患者支气管肺泡灌洗液标本中,细菌检出率占总病原微生物的37.68%,其中结核分枝杆菌占18.84%;病毒检出率占总病原微生物的44.93%,支原体、衣原体占17.39%;患者支气管肺泡灌洗液和鼻咽拭子标本中流感病毒A型的检出率分别为18.75%和26.92%.结论 多重检测技术平台对急性呼吸道感染疾病的病原微生物快速检测具有实用价值,尤其在解决流行病病原学分析方面具有重要意义.
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应用多重PCR鉴定对人致病的产气荚膜梭菌毒素
目的 研究用多重PCR的方法鉴定产气荚膜梭菌及分型毒素,为开展基因诊断做好准备. 方法 根据GenBank已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,设计出针对CPα、CPβ、CPE毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR的方法鉴定出产气荚膜梭菌并对其毒素基因进行分型. 结果 经电泳鉴定,多重PCR成功的扩增出预先设计的3条特异的目的条带. 结论 所设计的多重PCR反应体系能够得到产气荚膜梭菌的特异序列,同时能够鉴定分型3种对人致病的毒素序列,为进一步开展基因诊断打下基础.
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1例中间型β-地中海贫血的临床诊断和基因检测
目的：通过回顾性分析1例中间型β-地中海贫血（地贫）的诊断及基因检测流程，总结中间型地贫的诊断策略。方法分析1例β-地贫合并α-地贫基因型患儿的临床表现，通过地贫基因多重PCR检测及DNA序列测定明确诊断，结合相关文献复习，探讨影响β-地贫表现型的基因因素。结果该地贫患儿基因型为β珠蛋白基因41/42突变的杂合子合并αααanti3．7基因杂合子。结论中间型地贫的诊断，需要临床表现与基因病变相一致，多重PCR结合DNA序列测定等方法可确诊罕见型基因突变。
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正畸牙龈炎患者龈沟液中牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因的研究
目的 探讨正畸过程中牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因与牙龈炎症程度的相关关系,分析其在正畸牙龈炎发生发展中的作用.方法 收集102例来自济南市口腔医院正畸科和口腔内科患者组成正畸牙龈炎组(57例)、对照组(20例)、牙周炎组(25例),并记录其各临床指标,分别采集牙周袋深处或龈沟液标本,采用16SrDNA PCR和多重PCR对牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因进行检测,分析其与临床指标的关系.结果 102例患者临床标本,共扩增出牙龈卟啉单胞菌65株,其中正畸牙龈炎组35株；对照组7株；牙周炎组23株,经Spearman等级相关分析,牙龈卟啉单胞菌检出率与牙龈指数之间存在明显的正相关关系(P＜0.01).正畸牙龈炎组检出率明显高于对照组,牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组,三者之间有显著性差异(x2=15.918,P＜0.001),65例牙龈卟啉单胞菌阳性患者临床标本,扩增出rag基因的有52例,其中正畸牙龈炎组29例；对照组1例；牙周炎组22例,正畸牙龈炎组明显高于对照组,牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组,三者之间有显著性差异(x2=22.593,P＜0.001).结论 牙龈卟啉单胞菌致病岛rag基因与正畸治疗中牙龈炎性反应密切相关.
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志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立
目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.
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应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌
目的 探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性.方法 根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,T2;MT1,T2;IS5,S6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较.结果 92株结核分枝杆菌临床分离株中,0株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp 3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bp DNA片段,敏感性达100%,特异性为100%.结论 应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值.
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7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立
目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针，制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段，标记的产物与基因芯片上的探针杂交，经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下，评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸，比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本，进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应，检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致，实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法，为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。
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耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证
目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA，vanB）序列，设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针，制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段，标记产物与基因芯片上的探针杂交，经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下，评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性，灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法，利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。
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多重生物检测技术研究进展
多重生物检测因其快速、耗费少、所需样品量少等优点,被广泛用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及自身免疫相关抗体等抗原或抗体的快速筛查诊断.多重核酸检测的新技术包括巢式PCR(nPCR)、多重串联PCR、基于毛细管电泳的GeXP平台和luminex xMAP多重分析技术平台,多重免疫检测的新技术包括基于上转换发光、多线点、表面等离子共振技术的多重生物检测及基于蛋白芯片的阵列array-ELISA检测.本文综述了近年来多重生物检测新技术在呼吸道感染、腹泻、自身免疫性缺陷和肿瘤等疾病中的应用进展.
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9种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立
目的 建立一种能同时、快速、准确地检测包括:麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组 β型酿脓链球菌(溶血性链球菌)、伤寒沙门菌,9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的方法.方法 根据9种病原体特异基因中的高度保守区序列设计引物与探针,进行多重不对称PCR扩增,将带有标记的扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光显色后进行结果分析.经多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件的优化,评价该芯片的特异性、灵敏度和重复性.实时荧光PCR法与芯片法分别检测肠道病毒EV71梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度.结果 共筛选出9对特异性扩增引物和11条特异性检测探针.该芯片具有良好的特异性、灵敏度和重复性.质粒参考品和体外转录RNA参考品的低检测限为3×103拷贝/反应,芯片法的灵敏度为实时荧光PCR法的1/10.检测74例临床样本的灵敏度为95%,特异性为85.7%,总符合率为93.2%.结论 建立了一种可同时检测9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的检测方法,为发热伴出疹的临床诊断和流行病学调查提供了一种高通量的筛查手段.
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乳腺癌浸润淋巴结αT细胞受体谱型偏移分析
目的 应用多重PCR方法扩增TCRα链全长序列,分析乳腺癌浸润淋巴结αT细胞受体谱型偏移.方法 选取乳腺癌转移淋巴结,提取RNA后逆转录,多重PCR扩增TCRα链全长序列,构建重组质粒并测序,利用网上TCR资源分析序列.结果 2例患者各扩增出3个α链序列.乳腺癌TCRα限制性取用AV1、AV12亚家族.CDR3区序列分析增生T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 乳腺癌浸润淋巴结扩增的TCR家族存在限制性取用,克隆性增生T细胞CDR3序列不同.
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多重PCR扩增外周T细胞淋巴瘤TCR全长编码序列
目的 建立多重PCR 方法扩增外周T细胞淋巴瘤TCR β链全长编码序列.方法 根据现有文献,设计TCRβ链特异扩增引物.将退火温度接近的引物,组合配对进行多重PCR扩增并构建重组质粒,然后酶切鉴定.结果 扩增出外周T细胞淋巴瘤外周血中的TCRβ链全长序列并成功构建重组质粒.结论 建立了TCRD链全长编码序列的多重PCR扩增方法.
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志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术的建立
目的 探讨多重PCR技术在志贺菌感染快速诊断中的应用.方法 用多重PCR法对临床分离的68株志贺菌毒力基因shet1A、shet1B、ial和ipaH进行扩增检测.结果 68株志贺菌均在423bp(ipaH)处出现条带,在147bp(shet1B)、309bp(shet1A)、320bp(ial)处均出现了至少一个条带,与常规鉴定法的符合率达100%.结论 成功建立了志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术.
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应用多重PCR检测细菌性阴道炎支原体
目的 探讨多重PCR在检测细菌性阴道炎(BV)患者中3种常见支原体的应用价值,为生殖道支原体感染的监测和快速诊断提供理论依据.方法 提取泌尿生殖道标本中解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)、人型支原体(Mn)DNA,多重PCR扩增目的基因,电泳检测扩增产物.结果 在31份BV标本中检测Uu阳性标本16例,Mg阳性标本4例,Mh13例.其中6例为Uu和Mh感染,1例为Uu和Mg感染.结论 本研究初步验证了多重PCR技术能应用于BV标本3种常见支原体的快速检测,可望成为临床诊断与疾病监测的理想方法.
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小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立
目的 为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法.方法 根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipaH基因及空肠弯曲菌gyrA基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品.结果 多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp).该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌).特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带.使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数.结论 该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景.
关键词： 小肠结肠炎耶尔森氏菌 假结核耶尔森氏菌 志贺菌 空肠弯曲菌 多重PCR
