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中国食源性鼠伤寒沙门菌株耐药谱及PFGE分型研究
目的 了解掌握中国食品中鼠伤寒沙门菌的耐药状况,并对2002-2005年国家食源性疾病监测网分离的23株鼠伤寒沙门菌进行耐药性监测及PFGE分型研究. 方法 利用血清学方法对2002-2005年食源性疾病监测网分离的沙门菌进行分型,并运用CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推荐的纸片法对鼠伤寒沙门菌株进行耐药性检测,采用脉冲场凝胶电泳法(PFGE)进行PFGE分型. 结果 发现15株多重耐药鼠伤寒沙门菌,其中耐4～5种抗生素的6株(40%),耐6-9种抗生素的5株(33.3%),耐10种抗生素的4株(26.7%);可分为16个PFGE型,其中5个PFGE型的菌株数超过1株. 结论 我国食源性鼠伤寒沙门菌分离株的多重耐药性严重,PFGE分型方法对鼠伤寒沙门菌的分型能力较好,同-PFGE型菌株的耐药谱非常接近.
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鼠伤寒沙门菌多重耐药性机制研究进展
AcrAB外流泵系统的过度表达和拓扑异构酶基因突变是导致鼠伤寒沙门菌产生多重耐药性(MAR)的重要原因.AcrAB外流泵系统的合成有多重耐药调节子(marRAB)调控,AcrAB与多种抗生素的耐药有关.拓扑异构酶(topoisomerase)的突变主要与氟喹诺酮类药物的耐药性有关,突变主要发生在gyrA,parC基因上.
关键词： 沙门氏菌 鼠伤寒 药物耐受性 突变 DNA拓扑异构酶(ATP水解) -
2008-2009年美国食源性鼠伤寒沙门菌病暴发情况简介
2008年9月1日至2009年2月17日,美国发生了由鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)导致的食源性疾病暴发,44个州报告了642名实验室确诊病例,9人死亡.流行病学及实验室检测结果表明,致病食品为美国食品企业生产的污染了鼠伤寒沙门菌的花生酱.
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鼠伤寒沙门菌致幼儿腹泻的病例检测与调查分析
腹泻是危害儿童身体健康和生命安全的重要公共卫生问题之一.据估计2011年全球约有70万儿童死于腹泻[1],在一些发展中国家迁延性腹泻所致死亡占儿童腹泻死亡的比例高达50％以上[2].国内外调查显示,沙门菌感染是5岁以下儿童急性腹泻的主要原因之一[3-4].本研究于2014年在云南昆明某综合医院儿科开展腹泻监测时,从1例迁延性腹泻患儿粪便标本中先后3次检出鼠伤寒沙门菌.
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柯萨奇B组病毒VP1胞质表达系统的建立
目的利用T7RNA聚合酶介导的胞质表达系统增加目的抗原的表达量,提高基因疫苗的免疫效果.方法(1)构建带有T7启动子、脑心肌炎病毒(EMCV)5'非编码区和柯萨奇B组病毒衣壳蛋白VP1的质粒pT7 EMCVP1.将该质粒和编码T7 RNA酶的pAR 3132共转染HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞;(2)将上述质粒分别转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,让带有不同质粒的两种载体细菌共感染小鼠腹腔巨噬细胞.结果(1)经共转染,在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中,目的抗原VP1在胞质中的表达比单独转染真核表达质粒pcDNA3 VP1增加2～4倍;(2)两种质粒载体细菌感染小鼠巨噬细胞后,目的抗原VP1也能在细胞中较好表达.结论pT7 EMCVP1和pAR 3132能在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞胞质中表达,且表达量比单独转染真核表达质粒pcDNA3 VP1明显增加.
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1例心脏移植术后并发鼠伤寒沙门氏菌感染的护理
总结了1例心脏移植术患者后发生鼠伤寒沙门氏菌感染的护理.通过粪培养确诊,给予相应防止感染的护理措施和敏感抗生素治疗,感染及时得到控制,患者康复出院.
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北京市21株鼠伤寒沙门菌多重耐药和分子分型研究
目的 对北京市2009~2010年鼠伤寒沙门菌进行多重耐药及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型研究.方法 对2009~2010年通过北京市肠道门诊监测系统分离到的21株鼠伤寒沙门菌进行生化鉴定、血清分型并应用WHO推荐的Kirby-Bauer法进行药敏试验,脉冲场凝胶电泳法进行PFGE分型.结果 21株鼠伤寒沙门菌中有13株多重耐药菌株(61.9%),其中2~ 3种抗生素耐药4株(30.77%),4~5种抗生素耐药2株(15.38%),6~7种抗生素耐药2株(15.38%),8~9种抗生素耐药5株(38.46%).21株鼠伤寒沙门菌可分为17个PFGE带型,其中3个PFGE型的菌株数超过1株.结论 北京市鼠伤寒沙门菌分离株多重耐药较为严重,此次PFGE型别较多,且存在差异明显的多个克隆系,但同一PFGE型菌株的耐药谱较为接近.
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腹泻儿童沙门菌的耐药性研究及肠毒素基因与临床关系分析
目的 研究近年来本地区沙门菌肠炎患儿的临床特征、耐药状况及肠毒素与临床特征的关系,为临床病情的判断与治疗提供依据.方法 我院2004年4月至2009年12月从儿童腹泻患者粪便中分离的沙门菌80株,采用血清学凝集试验确定沙门菌血清型,再采用Kerby-Bauer纸片扩散法检测其对抗菌药物的敏感性;同时对肠毒素基因(spvA、spvB、rck)进行PCR检测,分析沙门菌肠炎患儿的临床特征与肠毒素的关系.结果 发热、腹泻为本病的主要临床表现.鼠伤寒沙门菌是小儿沙门菌肠炎的主要血清型(70/80,87.5%),其他血清型的沙门菌呈散发.80株沙门菌均对亚胺培南、美罗培南敏感,但对其他抗生素均有不同程度的耐药.66株沙门菌为多重耐药菌株,17株为可疑产β-内酰胺酶(ESBLs)菌株,8株为可疑产头孢菌素水解酶(AMPC)菌株,鼠伤寒沙门菌的多重耐药率明显高于其他血清型的沙门菌(X2=30.921,P=0.001).所有沙门菌均含有spvA基因,少数沙门菌含有spvB及rck基因,spvB阳性者高热的比率较spvB阴性者高(X2=7.544,P=0.006),spvB阳性者排黏液血便的比率较spvB阴性者高(X2=6.163,P=0.013).结论 沙门菌肠炎患儿以发热、腹泻为主要临床表现,鼠伤寒沙门菌是其主要病原菌,鼠伤寒沙门菌的多重耐药率明显高于其他血清型的沙门菌,spvB阳性菌株临床上更易表现为高热及排黏液血便,临床上需根据药敏结果合理使用抗生素.
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武汉地区门诊患者喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌耐药机制分析
目的 研究分析腹泻门诊患者中分离的喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌的耐药机制和遗传关系.方法 对2002-2005年问武汉同济医院腹泻门诊患者中分离的36株喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌进行了耐药谱测定,并通过PCR方法和序列测定对整合子、β内酰胺酶基因、喹诺酮耐药决定区的突变、qnr基因和aac(6')-Ib-cr基因进行了分析,运用脉冲场电泳方法(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)对所收集的菌株进行了分子分型,分析喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌的耐药机制和遗传关系.结果 喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌均为多重耐药株,普遍携带有Ⅰ类整合子,环丙沙星耐药菌株与敏感菌株在PFGE谱型上存在显著性差异,31株环丙沙星耐药菌株在喹诺酮耐药决定区中至少携带GyrA和ParC上的3个点突变,且在这些菌株中均检出了OXA-30基因,这些菌株对头孢吡肟的敏感性出现了不同程度的下降.结论 对环丙沙星耐药的鼠伤寒沙门菌在武汉地区已普遍存在,且这些菌株具有独特的遗传背景,建议在今后的细菌耐药性监测工作中应对这类细菌的耐药谱变化进行重点监测,尤其应加强对氟喹诺酮-三代头孢类抗菌药物均耐药菌株的针对性预警监测.
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鼠伤寒沙门菌对喹诺酮类耐药机制研究与基因分型
目的 检测鼠伤寒沙门菌(STM)对喹诺酮类药物的耐药性及耐药机制分析.方法 收集2004年7月1日至10月31日武汉地区4所医院门诊腹泻患者的可疑稀便分离培养出STM 33株;琼脂稀释法测其对喹诺酮类药物的低抑菌浓度(MIC);抽提细菌基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)检测喹诺酮类抗菌药物作用于STM的靶位点;REP-PCR对33株STM进行基因分型.结果 33株STM中有24株对环丙沙星产生较高耐药性(MIC 4～16μg/ml),24株耐药株中gyrA位点全都发生突变点,且双重突变占92%,parC位点发生突变率为91.6%;5株STM耐药株(MIC≥8μg/ml)parE和gyrB位点发现有碱基插入;基因分型达9种.结论 武汉地区社区内STM对喹诺酮类药物的耐药性严重,其主要机制是喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的基因突变,特别是多个位点同时突变导致高水平耐药;提示有社区流行趋势.
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细菌影载体负载防龋DNA疫苗免疫小鼠的效果研究
目的 研制鼠伤寒沙门菌细菌影,负载防龋DNA疫苗,探寻增强防龋DNA疫苗黏膜免疫效能的方法.方法将pREP4质粒和噬菌体PhiX基因E表达质粒同时转入鼠伤寒沙门菌减毒株J357中,加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,收集洗涤,负载防龋DNA疫苗,分4组经鼻免疫小鼠,分别为:细菌影+pGJGLU/VAX组,细菌影负载5μg防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX;细菌影+pVAX1组,细菌影负载5μg空载体pVAX1;pGJGLU/VAX组,布比卡因包裹5 μg pGJGLU/VAX; pVAX1组,布比卡因包裹5μg pVAX1.酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测唾液抗体产生结果.结果 ELISA结果显示经鼻黏膜免疫鼠伤寒沙门菌J357细菌影负载的防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX(细菌影+pGJGLU/VAX组)后,诱导了显著的唾液特异性抗葡聚糖结合区的IgA抗体,(x)±sx为(0.367 ±0.086) A/μg,与细菌影+pVAX1组[(0.122±0.077)A/μg]、pGJGLU/VAX组[(0.068±0.068)A/μg]和pVAX1组[(0.089±0.089) A/μg]相比,差异均有统计学意义(P值分别为0.028、0.012和0.030).结论 成功制备了鼠伤寒沙门菌细菌影,负载防龋DNA疫苗后经鼻黏膜途径免疫小鼠能有效提高免疫效能.
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减毒鼠伤寒杆菌为载体的幽门螺杆菌尿素酶口服疫苗的制备
构建能表达幽门螺杆菌(H. pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的重组减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB,Western blot检测UreB的表达.将SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠,12周后检测肠液和血清中的特异性抗体反应及脾细胞培养液上清中的IFN-γ和IL-10含量.结果显示,减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB能表达约61kD的蛋白,与H. pylori UreB亚单位相符,具有抗原性.口服免疫小鼠后,疫苗组小鼠的肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性IgA和IgG抗体,小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ和IL-10的含量亦明显升高.病理学检查显示疫苗组小鼠较对照组小鼠胃粘膜炎症指数无差异.提示表达H. pylori UreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB有望用作抗H. pylori感染的口服疫苗,其防治H. pylori感染的效果尚有待动物实验进一步证实.
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巨噬细胞过氧化物酶体与鼠伤寒沙门菌相互作用的初步分析
目的 观察巨噬细胞过氧化物酶体在鼠伤寒沙门菌感染中的作用.方法 将感染及未感染鼠伤寒沙门菌的鼠巨噬细胞RAW264.7以氮气压迫法裂解,逐级离心,用制备的Tassc多抗磁珠纯化得到粗提液,用Western blot法鉴定'FassC多抗磁珠与细胞结合物的性质;用pDsRed2-Perxi质粒转染RAW 264.7细胞以标记细胞中的过氧化物酶体,用三维荧光显微镜观察感染细胞中过氧化物酶体(红色)与表达绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门菌突变株的相互作用.结果 Western blot分析显示TassC多抗磁珠可以结合细胞内的TassC,并与细胞内的过氧化物酶体结合,也可以与感染细胞中的iNOS结合,而未感染样本中未检测到iNOS.磁珠洗脱物中未检测到溶酶体标志物LAMP1,也未检测到受染菌标志物;免疫荧光显示感染的巨噬细胞中过氧化物酶体聚集在鼠伤寒沙门菌突变株SCV周围,甚至发生重叠,随感染时间延长(1h或24h),过氧化物酶体数量增加(1.2倍或1.3倍),而胞内菌数量下降.结论 TassC可能定位于过氧化物酶体而不是溶酶体;感染鼠伤寒沙门菌的巨噬细胞中iNOS可能与过氧化物酶体结合而参与杀灭微生物的作用.
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鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测
作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素（stn）基因插入失活型与缺失型突变的重组自杀载体质粒，通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株2000染色体上野生型stn基因发生同源交换，筛选获得stn基因突变的同源突变菌株。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明，突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱，而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高，提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。
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鼠伤寒沙门菌对巨噬细胞内过氧化物酶体与诱导型一氧化氮合酶结合的诱导作用
目的 探讨鼠伤寒沙门菌感染早期巨噬细胞内过氧化物酶体及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的作用.方法用pTassC-GFP质粒转染鼠巨噬细胞RAW 264.7,以观察标记了绿色荧光蛋白的靶向沙门菌分泌的SpiC蛋白(TassC)在胞内的存在形式.用pDsRed2-Perxi和pTassC-GFP质粒共转染RAW 264.7细胞,将阳性细胞命名为RAW-DT,用pDsRed2-Perxi质粒转染RAW 264.7细胞,阳性细胞命名为RAW-D.采用Alexa Fluor 350对结合单抗的鼠伤寒沙门菌显色,用Alexa Fluor 488对iNOS进行显色,并在荧光显微镜下观察.用鼠伤寒沙门菌感染RAW-DT细胞,以观察鼠伤寒沙门菌与TassC和过氧化物酶体的关系；用鼠伤寒沙门菌感染RAW-D细胞,以观察iNOS与过氧化物酶体和鼠伤寒沙门菌的关系.结果 免疫荧光观察显示,呈现绿色荧光的TassC-GFP有膜性结构,可与标记了红色荧光的过氧化物酶体共定位；感染1h的RAW-DT胞内鼠伤寒沙门菌吞噬泡可招募TassCGFP和过氧化物酶体；感染1h的RAW-D胞内鼠伤寒沙门菌吞噬泡可与iNOS和过氧化物酶体共定位；在1h的观察期间,一旦鼠伤寒沙门菌进入巨噬细胞,膜性小泡(SCV)周围即可募集较多过氧化物酶体.结论 野生型鼠伤寒沙门菌可诱导巨噬细胞产生iNOS,iNOS和TassC均可与过氧化物酶体结合,可能具有一定的杀菌作用.
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鼠伤寒沙门菌感染的巨噬细胞铁代谢相关基因表达谱
目的 评估宿主与病原体相互作用中铁代谢的作用.方法 用荧光定量PCR法检测感染及未感染鼠伤寒沙门菌的鼠RAW264.7巨噬细胞13种铁代谢相关基因的表达.结果 活的野生型鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞1h或24h后可诱导转铁蛋白受体(Tfr1)的表达,引起细胞内动态铁池持续上涨.基因表达分析显示野生型鼠伤寒沙门菌通过诱导铁氧还原酶(Steap3)、铁膜转运蛋白(Dmt1)、铁调节蛋白(Irp1和Irp2)的表达主动吸收铁,而经铁转运蛋白(Fpn1)的铁外流并无明显改变.用鼠伤寒沙门菌spiC-突变株感染巨噬细胞1h或24h后并未引起Tfr1 mRNA水平增高,而Fpn1 mRNA水平在感染24h时要高于感染1h时,提示spiC-突变株感染24h后动态铁池下降.结论 野生型沙门菌在感染1h或24h后积极地驱动了转铁蛋白介导的铁吸收程序.本研究使用的spiC-突变株感染细胞24h后铁外流高于感染1h时.
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志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立
目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.
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鼠伤寒沙门菌感染30例临床分析
1990～1991年,我们收治鼠伤寒沙门菌感染30例,临床分析报告如下.1 临床资料1.1 一般资料年龄小者产后2天,大70岁,其中新生儿9例,1岁以内14例,60岁以上2例.男22例,女8例.四季均有发病,以肠道感染收住院者(饮食型)多集中于7～9月份,院内感染者(生活接触型)集中于12月至翌年3月.病例均经大便和(或)血培养阳性证实.
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靶向抗原递呈细胞激活Flk1重组减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其抑制树突状细胞凋亡的初步研究
目的 观察靶向抗原递呈细胞激活血管内皮生长因子受体-2(Flk1)的重组减毒鼠伤寒沙门菌对树突状细胞凋亡的抑制作用.方法 构建含Flk1与靶向抗凋亡基因BAK siRNA的重组质粒载体pFlk1-U6BAK,将其转化至减毒鼠伤寒沙门菌株中,携带pFlk1-U6BAK和pFlk1的重组减毒鼠伤寒沙门菌分别感染经体外培养的小鼠树突状细胞;Western blotting法检测树突状细胞Flk和BAK表达水平,MTT法检测树突状细胞增殖活性.结果 成功构建了含Flk1和靶向抗凋亡基因BAK siRNA的重组质粒载体pFlk1-U6BAK.经携带pFlk1-U6BAK的重组减毒鼠伤寒沙门菌感染后,树突状细胞在稳定表达Flk的同时,BAK表达水平显著降低;而经携带pFlk1-U6BAK的重组减毒鼠伤寒沙门菌感染后,树突状细胞增殖活性明显升高.结论 携带pFlk1-U6BAK的重组减毒鼠伤寒沙门菌可以在稳定表达Flk的同时,通过下调凋亡基因BAK表达水平而抑制树突状细胞凋亡,有望成为较为有效的抗肿瘤血管生成疫苗.
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TGF-β1抑制伤寒沙门菌诱导巨噬细胞RAW 264.7凋亡的实验研究
目的:探讨转化生长因子(TGF)-β1在伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡过程中的调节作用.方法:ELISA检测伤寒沙门菌诱导小鼠巨噬细胞系RAW 264.7培养卜清中TGF-β1分泌水平,实时定量PCR检测伤寒沙门菌诱导小鼠巨噬细胞TGF-β1 mRNA的表达,流式细胞术观察外源性TGF-β1对伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡的影响.结果:伤寒沙门菌感染组巨噬细胞TGF-β1的分泌和mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05);伤寒沙门菌热杀死组、伤寒沙门菌感染组巨噬细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),LPS+伤寒沙门菌感染组的巨噬细胞凋亡率显著高于细菌脂多糖(LPS)组(P<0.05);1～100μg,L 3个浓度的TGF-β1组的巨噬细胞凋亡率显著低于伤寒沙门菌感染组(P<0.05),并呈一定的剂依赖关系.结论:伤寒沙门菌能够诱导小鼠巨噬细胞系RAW 264.7表达TGF-β1,不同剂量的外源性TGF-β1能够抑制伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡的过程,提示TGF-β1在伤寒沙门菌诱导巨噬细胞的凋亡过程具有调节作用.
