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大连市蚊媒调查及淡色库蚊、三带喙库蚊自然感染流行性乙型脑炎病毒研究
[目的]了解大连市蚊虫种类及生态习性及淡色库蚊、三带喙库蚊自然感染流行性乙型脑炎病毒情况.为蚊虫防制提供了生态学依据,为预报流行性乙型脑炎的发生时间和流行强度提供科学依据.[方法]用帐诱法、灯诱法、采集幼虫等方法进行调查,并应用逆转录一聚合酶联反应技术(RT-PCR)进行乙脑病毒鉴定.[结果]大连市捕获蚊虫3属9种.其中.按蚊属1种,伊蚊属4种,库蚊属4种;大连市蚊虫于5月出现,8月达到高峰,9月逐渐减少.10月消失;侵袭人类以淡色库蚊(占47.98%)、东乡伊蚊(占12.15%)和背点伊蚊(占10.41%)为多;夜间以库蚊和按蚊活动为主,白天为白纹伊蚊;不同场所蚊虫密度差异反映出蚊虫的不同嗜血习性,淡色库蚊、凶小库蚊和白纹伊蚊喜嗜人血,淡色库蚊同时喜嗜猪、牛血;三带喙库蚊偏嗜猪血,中华按蚊偏嗜牛血,背点伊蚊和刺扰伊蚊偏嗜猪、牛血;2007年8月中旬首先在三带喙库蚊中检出乙脑病毒,共检测70批次样本,阳性率为4.28%.[结论]淡色库蚊、东乡伊蚊、背点伊蚊是大连市危害人类的主要蚊种.大连市蚊虫自然感染乙脑病毒于8月中下旬开始,三带喙库蚊首先染毒.
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85例流行性乙型脑炎的临床分析
流行性乙型脑炎(简称乙脑)是由流行性乙型脑炎病毒引起的中枢系统的传染病.本病流行于夏秋季,主要集中在7、8、9月份.临床表现以急性发热、头痛起病,迅速出现意识障碍、惊厥、脑膜刺激征等中枢神经系统症状,重者病死率高,幸存者也往往留有后遗症.发病年龄多在2～10岁.现将我院1994-2005年收治的85例患者报告如下.
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乙脑病毒持续感染株preM区序列分析
为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒.利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较.preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸).对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同.认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关.
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从云南省蝙蝠脑组织中分离出乙型脑炎病毒
为进一步阐明蝙蝠在保存乙脑病毒中的作用，于1997年7月，在云南省耿马 县捕捉蝙蝠64只，取脑组织作病毒分离，从一只金管鼻蝠脑组织中分离出1株病毒。该毒株 能引起BHK21细胞病变和乳鼠发病死亡，在pH5.75～7.4时能凝集鸽红血球，经用单克隆抗 体血凝抑制和免疫荧光试验鉴定，证实为乙型脑炎病毒。进一步证明蝙蝠在乙型脑炎病毒保 存和扩散中具有重要作用。从金管鼻蝠体内分离出乙型脑炎病毒属国内外首次报道。
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云南省4种伊蚊的乙型脑炎病毒分离物的研究
在云南省西南边境9县市捕获伊蚊属雌性成蚊16种19367只,用细胞法和乳鼠法分离病毒.从185批6491只白纹伊蚊中分离到病毒2株,从50批1605只剌扰伊蚊中分离到病毒2株,从23批772只窄翅伊蚊中分离到病毒2株,从4批103只阿萨姆伊蚊中分离到病毒1株.其它12种共10396只伊蚊的病毒分离物为阴性.分离到的7株病毒经免疫荧光、酶免疫、血凝抑制和中和试验鉴定,均为乙型脑炎病毒(JE virus).白纹伊蚊是野外竹林的优势蚊种.分析认为白纹伊蚊在当地乙型脑炎病毒保存和传播中起重要作用,刺扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊亦可参与该病毒的传播.
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广东和广西部分地区蝙蝠携带登革病毒及流行性乙型脑炎病毒的调查研究
目的了解广东及广西蝙蝠携带登革病毒和流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的情况.方法 2004年9月至2005年11月期间11次收集广东及广西部分地区的蝙蝠.收集的蝙蝠取脑组织标本和血清标本,采用两对登革病毒和乙脑病毒通用引物,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞培养分离方法检测所采集蝙蝠标本中的登革病毒(dengue virus,DV)和乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV).结果收集了4个科9个种共905只蝙蝠,其中棕果蝠154只、犬蝠395只、普通长翼蝠5只、小黄蝠52只、中菊头蝠228只、中华菊头蝠15只、小菊头蝠41只、双色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只.蝙蝠来源于粤中、粤西和桂东的7个县市.905只蝙蝠标本中未检测、分离到登革病毒和乙型脑炎病毒.结论未发现所调查的蝙蝠携带登革病毒和乙型脑炎病毒.
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流行性乙型脑炎病毒研究进展
流行性乙型脑炎病兄率较高,后遗症严重,在亚洲地区危害较大.本文就乙脑病毒的分类、抗原特性、对细胞和动物敏感性、基因组的结构特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究进展作一综述.
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流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及高效表达研究进展
流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)是乙型脑炎病毒Iencephalitis B Vims),又称日本脑炎病毒(Japanese EncephalitisVirus,JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病.
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深圳市龙岗区蚊虫自然感染流行性乙型脑炎病毒状况调查
目的 研究深圳市龙岗区蚊虫流行性乙型脑炎病毒自然感染状况,为预测该地区乙脑发病趋势及流行强度,制定有效预防控制措施提供科学依据.方法 采用灯诱法捕捉蚊虫标本并进行分类鉴定,以JEV的NS3基因区段设计特异引物,通过实时荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)对蚊虫中流行性乙型脑炎病毒进行检测,阳性标本经测序后再在GenBank中进行核苷酸序列的同源性比对.结果 捕获的蚊虫隶属3属5种,致倦库蚊是优势蚊种;1 533只蚊虫分成25批,从3批致倦库蚊标本中检出JEV核酸阳性,阳性率为12％.阳性标本与GenBank中报道的JEV参考株间相应的核苷酸序列同源性达99％以上,均属于JEV Ⅰ型病毒.结论 龙岗区存在着蚊虫自然感染JEV,致倦库蚊是区内乙脑传播的主要蚊媒,有流行人间和畜间流行性乙型脑炎的潜在危险,提示应进一步完善疫苗接种和免疫监测,积极开展消除蚊虫孳生地,灭蚊、防蚊工作,以控制和切断乙脑传播途径.
关键词： 流行性乙型脑炎病毒 蚊 实时荧光RT-PCR -
流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
目的;获得JEV E蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达.方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEV E蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEV E,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%.结论:在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础.
关键词： 流行性乙型脑炎病毒 E蛋白基因 反转录-聚合酶链反应 基因克隆 表达载体 -
云南省脑炎患者脑脊液中检测到基因Ⅰ和Ⅲ型流行性乙型脑炎病毒
目的 调查云南省流行性乙型脑炎(乙脑)患者感染乙脑病毒(JEV)基因型状况.方法 在云南省西双版纳州医院和大理州医院采集脑炎患者急性期血清标本20份和脑脊液标本11份,用RT-PCR法检测JEV核酸,阳性者进行JEV-PreM/C区基因序列测定,用核苷酸同源性和系统进化分析进行基因型鉴定.结果 用RT-PCR法从11例脑炎患者脑脊液标本中检测到JEV核酸阳性3份(JB114、JB135和DLN24),而20例脑炎患者血清标本均为阴性.3株病毒的PreM/C区核苷酸序列同源性分析显示,JB114、JB135与JEV基因Ⅰ型代表株同源性高达98.3％和99.2％,而与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型仅为82.5％～84.6％;DLN24与基因Ⅲ型代表株同源性为94.6％,而与基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分别为85.0％、82.5％和80.4％.进化树分析显示,JB114和JB135位于基因Ⅰ型分支中,DLN24位于基因Ⅲ型分支上.结果表明,来自西双版纳的JB114和JB135病毒株属于基因Ⅰ型,来自大理的DLN24病毒株为基因Ⅲ型.结论 云南省乙脑患者中分别存在基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV感染的病例,表明云南省存在这两个基因型病毒的共同流行.
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云南新分离2株基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒的全基因组序列分析
目的 对云南省新分离的2株流行性乙型脑炎(乙脑)病毒进行全基因组序列测定和分析,了解当地乙脑病毒基因组结构及分型特征.方法 设计乙脑病毒全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片段,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列.通过Clustal X(1.8)、DNASTAR、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 从2007年云南省捕获的三带喙库蚊中分离到2株乙脑病毒(TC07018、TC07172),并对病毒株的全基因组序列进行了分子生物学研究,结果 提示TC07018、TC07172株与JEVMie40株的核苷酸同源性高,为98.4％和98.7％,与JKT6468株核苷酸同源性低,为83.6％和83.5％.2个分离株与JEVMie40、SH17M-07和HEN0701株氨基酸同源性高,均为99.6％,与JKT6468株氨基酸同源性低,为95.5％和95.4％.2个新分离株与我国现在常用的疫苗株SA14-14-2相比较,核苷酸同源性为88.7％和88.6％,氨基酸同源性为97.1％.基于全基因序列,从基因库中选择了36株乙脑病毒与分离株进行进化分析,2个新分离株与KV1899和HEN0701的进化关系接近,都属于基因Ⅰ型.结论 新分离的2株乙脑病毒属于基因Ⅰ型,此为滇西地区首次分离该型病毒.这2株病毒与国内外基因Ⅰ型乙脑病毒流行株间存在一定差异,但根据抗原和毒力位点分析表明,乙脑SA14-14-2疫苗株能保护该型病毒.
