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一例狂犬病病例的实验室诊断及其启示
目的 通过1例人狂犬病病例的实验室确诊探讨人狂犬病病例实验室诊断的可行性及其对狂犬病防控的意义.方法 对存活疑似人狂犬病病例的唾液、脑脊液、血清标本采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)进行实验室确诊;通过RFFIT对密切接触个例血清抗狂犬病病毒中和抗体进行检测.结果 病例唾液标本用RT-PCR方法检测获得狂犬病病毒核蛋白、RNA聚合酶基因预期扩增片段,序列测定和分析进一步证实为狂犬病病毒.病例血清标本经RFFIT检测抗狂犬病病毒中和抗体阳性.1名病例密切接触者按照狂犬病暴露进行暴露后预防处置,血清抗狂犬病病毒中和抗体检测为阳性.结论 1例疑似人狂犬病病例经实验室诊断确诊为狂犬病病例,实验室检测结果对指导个案处置有现实意义.
关键词： 狂犬病 反转录-聚合酶链反应 快速荧光灶抑制试验 实验室诊断 -
2012年辽宁省铁岭市食源性致病菌监测中检测出1例诺如病毒
目的 了解辽宁省铁岭市水产品中食源性致病菌的污染状况,有效预防控制食源性疾病的发生.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对2012年第一季度食源性致病菌常规监测采集到的6份水产品进行检测,对阳性PCR产物进行基因测序.结果 6份水产品中,有1份检测出诺如病毒RNA阳性.测序结果分析显示,该阳性标本的诺如病毒VP1全基因序列测定和分析显示为GⅡ-4型诺如病毒.结论 铁岭市首次在食源性致病菌日常监测中检测出诺如病毒GⅡ-4型.因此应加大对生食水产品的监督检查力度,避免因诺如病毒引起的病毒性胃肠炎暴发.
关键词： 食源性致病菌 诺如病毒 反转录-聚合酶链反应 -
双调蛋白在人体睾丸组织的表达特征
目的 确定双调蛋白在人体睾丸组织和精子的表达特征,比较双调蛋白在正常人和隐睾症患者睾丸组织的表达差异. 方法 收集正常睾丸组织、精液精子和隐睾症患者的睾丸组织,采用反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫组织化学的方法检测双调蛋白的表达水平. 结果 双调蛋白在正常睾丸组织和精子均有表达,主要分布于睾丸长型精子细胞和成熟精子尾部;与正常睾丸组织比较,双调蛋白在隐睾组织的表达显著减少、隐睾组织生精小管的表达基本消失. 结论 在隐睾症睾丸中双调蛋白的表达显著减少,提示双调蛋白表达与睾丸发育有一定关系.
关键词： 双调蛋白 睾丸 隐睾症 反转录-聚合酶链反应 免疫细胞化学 -
确证检测HCV在某些临床情况时的临床意义
目的:了解HCV-IgG阳性时,仅肝功能轻度异常时、有丙型肝炎或HCV接触史等临床情况下HCV在血液内存的几率,了解在这些临床情况下开展检测HCV确证试验的临床意义.方法:以轻度肝功能异常而无其他阳性发现者、HCV-IgG阳性者、有丙型肝炎或HCV接触史为实验对象,血清为检测标本,用ELISH技术检测HCV-IgG,RT-PCR技术检测HCV.结果:血清RT-PCR-HCV的检出率,HCV-IgG阳性组为41.9%、仅肝功能轻度异常组为25.7%、无症状体检组为29.4%.结论:本实验,各临床情况组均有不同的PCR-HCV阳性检测结果.提示,临床对HCV-IgG阳性者、仅肝功能轻度异常者、有接触史者等特殊人群应做检测HCV的确证试验,RT-PCR技术可以用做临床检测HCV的确证试验方法.
关键词： 丙型肝炎病毒 反转录-聚合酶链反应 确定试验 临床意义 -
贝类中诺如病毒的研究进展
从贝类中诺如病毒的污染现状、检测组织靶点、病毒浓缩方法及效率、检测方法有效性等多个方面评述贝类中诺如病毒的研究现状、进展、急需解决的问题和未来的发展方向,以期为制定诺如病毒检测技术标准及我国贝类进出口贸易提供参考.
关键词： 诺如病毒 贝类 检测靶点 病毒浓缩 反转录-聚合酶链反应 -
北京市2007年手足口病暴发疫情的病原学分析
目的 对北京市2007年5-7月间发生并收集到的8起手足口病暴发疫情进行病原学分析及鉴定.方法 采用RT-PCR技术,对手足口病患儿的疱疹液或咽拭子标本,直接进行肠道病毒(EV)分型;采用RD传代细胞,对标本进行病毒分离培养,再对其阳性培养物进行EV分型.对其中部分原始标本和阳性分离物中的EV VP1区进行核苷酸序列及预测的氨基酸序列分析.结果 北京市2007年发生在大兴区的2起疫情由EV71引起,其他4个区的6起疫情均由柯萨奇病毒A16型(Cox A16)引起.大兴区2起疫情的EV71都属于C基因型的C4亚型,但分别处于VP1基因亲缘性系统发生树的不同分支,其核苷酸和氨基酸分别存在3.7%和0.8%的差异;来源于顺义区的Cox A16与其他病毒分别处于不同分支,其核苷酸和氨基酸分别存在3.7%和0%的差异.结论 北京市2007年手足口病疫情主要由EV71和Cox A16两种病原引起,而每种病原都存在2个或2个以上流行株病毒;且Cox A16的传播似乎较EV71更为广泛.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A16型 反转录-聚合酶链反应 -
利用反转录环介导等温扩增技术检测麻疹病毒
目的 建立一种快速检测麻疹病毒的方法.方法 以分离到的麻疹病毒RNA为模板,利用环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计合成3套引物,特异型识别病毒基因的8个位点,在反转录酶作用下,63℃扩增60 min,80℃2 min终止反应,终产物分别经凝胶电泳和荧光目视观察.通过real-time仪实时监测反应过程,同时将该方法的灵敏度、特异度与常规RT-PCR、real-time RT-PCR进行比较.结果 RT-LAMP反应约1h即可完成,终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度的扩增条带,目视显示反应液颜色由黄色变为绿色.灵敏性是常规RT-PCR和real-time RT-PCR的100倍.结论 RT-LAMP方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等特点,适用于基层和现场使用.
关键词： 麻疹病毒 反转录环介导等温扩增 反转录-聚合酶链反应 -
Beclin1和Atg5在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义
目的 探讨自噬相关基因Beclin1和Atg5在不同卵巢组织中的表达情况及其临床意义.方法 免疫组化和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤以及上皮性卵巢癌组织的Beclin1和Atg5的mRNA和蛋白的表达情况,分析3组间的差异.结果 正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤中Beclin1和Atg5的mRNA和蛋白表达明显高于上皮性卵巢癌组织(P＜0.05).结论 Beclin1和Atg5在上皮性卵巢癌组织中的表达下降,上皮性卵巢癌发生、发展可能与自噬相关基因Beclin1和Atg5白噬活性的抑制有关.
关键词： Beclin1 Atg5 卵巢肿瘤 免疫组化 反转录-聚合酶链反应 -
肝细胞核因子6在小鼠肝内胆管发育过程中的表达
目的 探讨肝细胞核因子6(HNF6)在肝内胆管发育过程中的作用. 方法 用RT-PCR及免疫组织化学等方法 检测HNF6在小鼠胚胎发育的各个阶段以及成年肝中的表达. 结果 RT-PCR结果 显示,HNF6 mRNA的表达在E9d开始出现,与肝芽形成的时间吻合,E13d HNF6 mRNA的表达消失,E15d又重新出现,并一直维持到出生.免疫组织化学显示,CK19免疫反应在E13d开始出现,此时免疫反应阳性细胞在肝索内散在分布.E15d时在近肝门处的门管区丌始出现由单层的、CK19阳性细胞组成的胆管板,之后,阳性细胞反应主要分布于胆管板和小叶间胆管.E9～11d,多数肝索细胞呈HNF6阳性反应,E13d的肝索中未观察剑HNF6的表达.E15～17d,HNF6阳性反应的分布与CK19相似,成年小鼠肝的胆管上皮细胞仍呈HNF6阳性反应. 结论 HNF6可能与肝干细胞的特化关系不大,而与肝发育的启动、肝干细胞向胆管上皮细胞的分化及其分化状态的维持有关.
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孤儿肽在自发性高血压大鼠和家兔心血管系统的分布
目的研究孤儿肽(orphanin FQ,OFQ)在自发性高血压大鼠和家兔心血管系统的分布. 方法采用反转录 -聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学方法. 结果 RT-PCR的结果显示,OFQ的前体mRNA在自发性高血压大鼠的主动脉、肺动脉、肾动静脉均有较高的表达,其表达水平与脑组织表达水平相似,心房组织也有弱的表达,但在心室组织未见OFQ前体mRNA的表达.免疫组织化学结果显示,心肌细胞OFQ免疫反应阴性,心房内膜的内皮细胞和主动脉、肾动静脉的内皮细胞及血管平滑肌细胞均含有OFQ免疫反应阳性颗粒,此外在肾小球也观察到了OFQ反应阳性细胞. 结论 OFQ可能是对心血管系统和肾脏功能有一定调节作用的调节肽,但其具体的功能及调节机制尚待进一步研究.
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细胞外调节蛋白激酶信号通路参与机械牵张诱导肺泡上皮细胞高迁移率族蛋白B1的表达调控
目的 探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用. 方法 肺泡上皮细胞A549分为A、B、C 3组,A组为对照组;B组A549细胞施加14%牵张应变,牵张时间为4 h;C组细胞的牵张模式与B组相同,只是于施加牵张前用ERK的特异性抑制剂PD98059预处理A549细胞2h.分别用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达,用Western blotting检测ERK激酶的活性. 结果 A549细胞施加14 %牵张应变后,HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加,ERK激酶活性明显增高(P＜0.05);该诱导激活作用可被PD98059阻断. 结论 机械牵张通过ERK信号通路,调节A549细胞的HMGB1基因和蛋白表达
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松果体摘除及褪黑素对大鼠胸腺上皮细胞白细胞介素-7表达的影响
目的 探讨松果体摘除及褪黑素对大鼠胸腺上皮细胞白细胞介素7(IL-7)表达的影响及其意义.方法 1.培养大鼠胸腺上皮细胞,应用广谱角蛋白抗体进行免疫细胞化学显色鉴定;MTT法观察褪黑素(1×10-3～10-9mol/L)干预对细胞生长的影响;细胞分空白对照组、褪黑素10-8mol/L处理组和褪黑素10-6mol/L处理组,RT-PCR法观察细胞IL-7 mRNA的表达;2.选用清洁级雄性SD大鼠110只,分为正常对照组、假手术对照组、松果体摘除组、松果体摘除+褪黑素7.5ms/(kg·d)腹腔注射组和松果体摘除+褪黑素15mg/(kg·d)腹腔注射组.术后4周和8周取材,运用免疫组织化学和RT-PCR方法 观察胸腺上皮细胞IL-7表达的变化. 结果 褪黑素干预对大鼠胸腺上皮细胞的生长无显著影响,但能使IL-7 mRNA的表达水平呈剂量依赖性升高;松果体摘除对大鼠胸腺上皮细胞表达IL-7无显著影响,补充褪黑素15mg/(kg·d)4周后IL-7表达显著增高,8周后均下降至正常水平. 结论 松果体及褪黑素可能通过影响大鼠胸腺上皮细胞IL-7的表达,从而调节胸腺细胞的分化发育.
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丹参促进小鼠冻融卵巢移植早期血管内皮生长因子的表达
目的 探讨丹参对小鼠冻融卵巢同种异体移植后的血管化作用及可能机制.方法 收集C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠杂交的F1代 4周龄小鼠卵巢,慢速冻融后移植至B6C2 F1代8~12周龄雄鼠的肾被膜下,移植后小鼠按给药不同分为生理盐水组和丹参组,分别于移植后1d(24h)、2d(48h)和7d回收移植物,将冻融以及移植后不同时间段的卵巢组织进行HE染色全卵巢卵泡计数,免疫组织化学及RT-PCR方法检测血管相关蛋白及基因的表达.结果 移植卵巢组织各时间段全卵巢卵泡计数及卵泡存活率丹参组均高于生理盐水对照组(P<0.05);移植后小鼠血管内皮生长因子(VEGF)的表达有上升趋势,第7天达高峰,两组之间无显著性差异(P>0.05);移植卵巢组织各时间段细胞凋亡指数,丹参组均低于生理盐水对照组(P<0.05);移植后48h丹参组VEGF188mRNA和VEGF164mRNA的表达量较对照组高,两组之间有显著性差异(P<0.05).结论 小鼠卵巢组织移植后早期阶段丹参能促进卵泡发育,减少卵泡凋亡,可能与提高移植卵巢组织内血管相关基因VEGF(主要是VEGF164mRNA和VEGF188mRNA)的表达而促进移植后早期血管化有关.
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持久饥饿对涡虫转氨酶、磷酸酶、蛋白水解酶和增殖细胞核抗原的影响
目的 探讨持久饥饿对涡虫转氨酶、磷酸酶、蛋白水解酶和增殖细胞核抗原(PCNA)的影响. 方法 采用全自动生化分析仪测定转氨酶的活性变化,用复性电泳技术分析磷酸酶和蛋白水解酶的变化,用半定量RT-PCR技术分析PCNA mRNA的表达变化.结果 饥饿过程中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性显著升高,是对照水平的10倍以上,恢复喂食后逐渐降低到正常水平;碱性磷酸酶(ALP)的活性在饥饿过程中明显减弱,而酸性磷酸酶(ACP)活性却显著增强;受饥饿影响,140kD和40kD蛋白水解酶的活性均明显增加;然而饥饿过程中PCNA的表达没有明显变化,说明饥饿对该基因的影响很小. 结论持久饥饿对涡虫的生理和生化代谢有重要影响,酶活性的变化反应了涡虫适应持久饥饿的能量代谢变化.
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斯钙素1基因在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌发生中的表达
目的 检测哺乳动物斯钙素1(STC1) mRNA和STC1蛋白在二乙基亚硝胺(DENA)诱导大鼠肝癌发生不同阶段的表达水平. 方法 选取80只SD大鼠,随机分为两组,实验组按DENA 70 mg/kg体重灌胃,诱导大鼠肝癌模型,对照组等量蒸馏水灌胃.采用组织病理学、RT-PCR和Western blotting技术分析大鼠肝组织中的STC1基因和蛋白表达水平. 结果只有在DENA诱导的大鼠肝癌组织内才有STC1 mRNA表达和STC1分泌,并且与肝癌发生进程具有相关性. 结论 STC1基因表达和STC1分泌水平与肝细胞癌变具有相关性,可望成为用于肝癌诊断的分子标记物.
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Napsin A基因转染干预A549细胞的上皮-间质转化
目的 探讨Napsin A基因转染至A549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至A549细胞染色体中并鉴定.用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化,观察Napsin A基因转染对A549细胞在体外EMT模型中细胞EMT和表达黏着斑激酶(FAK)的影响.结果重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因A549细胞表达Napsin A蛋白显著高于非转基因细胞组(P＜0.01).细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,E钙蛋白的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P＜0.01),相反Ⅰ型胶原则显著上调(P＜0.01),提示体外构建EMT模型获得成功.转Napsin A基因A549细胞在TGF-β1干预后,其细胞形态间质改变、E钙蛋白和Ⅰ型胶原的表达量也发生相似变化趋势,但变化幅度显著变小(其中E钙蛋白:P＜0.01,Ⅰ型胶原:P＜0.05).体外EMT模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(P＜0.01),但转基因细胞上调趋势明显小于未转基因细胞(P＜0.01).结论转染Napsin A基因至A549细胞可以部分阻滞细胞EMT进程,其作用机制可能与抑制整合素信号转导通路有关.
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NF-κB及调节活化正常T细胞表达和趋化因子在升主动脉瘤形成中的表达
目的 探讨激活的NF-κB及调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)的表达及其在升主动脉瘤形成中的作用.方法 4周龄雌性Wistar大鼠40只,随机分成升主动脉瘤组(20只)和正常对照组(20只).制作升主动脉瘤动物模型,术后3个月取材,免疫组织化学方法分析NF-κB、RANTES的蛋白表达,RT-PCR方法检测其mRNA的表达.结果 模型组动脉壁NF-κB和RANTES表达明显升高,而正常动脉壁中未见或极少见NF-κB和RANTES表达.RT-PCR显示,模型组的动脉瘤内NF-κB和RANTES mRNA表达增强,两者呈显著性正相关.结论 NF-κB和RANTES在动脉瘤中表达强于对照组,NF-κB和RANTES在升主动脉瘤病变的发生发展过程中可能起重要作用.
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不同体外条件培养对大鼠血管平滑肌细胞表型、增殖和细胞骨架的影响
目的 探讨不同体外培养条件与血管平滑肌细胞(VSMCs)表型、增殖和细胞骨架蛋白表达之间的差异及生物学意义.方法 体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,实验分为6组:2代对照组、2代血清饥饿组、4代对照组、4代血清饥饿组、6代对照组和6代血清饥饿组;用5-Brdu标记增殖细胞;RT-PCR检测表型基因SM22ɑ mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白SMɑ-actin、β-Tubulin和Desmin的表达. 结果 体外培养的VSMCs,随培养代数的增多,细胞骨架蛋白表达减少,电镜超微结构可见胞质中内质网、高尔基体等细胞器增多,有大量的分泌小泡;血清饥饿胞中线粒体增多并电子密度增高. 血清培养条件下SMɑ-actin随培养代数的增加其表达减少,血清饥饿培养可使SMɑ-actin表达可逆性上调;β-Tubulin和Desmin随培养代数的增加表达减少更明显,而血清饥饿上调作用也不明显,至第6代基本不表达. 结论 血清培养和血清饥饿培养在不同代中对VSMCs表型转化、增殖和细胞骨架有着不同的影响,它们之间存在着内在的联系,在维持细胞形态、收缩功能和血管重构方面起了重要作用.β-Tubulin和Desmin表达消失可能具有重要生物学意义.
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大鼠肺微血管内皮细胞磷酸二酯酶mRNA表达与活性检测
目的 检测大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)内磷酸二酯酶(PDE)同功酶mRNA表达及基础酶活性,明确PMVECs存在的PDE亚型及体外活性. 方法 采用植块法分离培养PMVECs,RT-PCR法测定PDE mRNA表达,以高效液相色谱(PHLC)检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性. 结果 检测结果 显示,PMVECs中含有PDE1A、1C、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、10A、11A共17种PDE mRNA,而PDE1B mRNA 未见表达,酶量在5～20μl范围内与PDE活性存在良好的线性关系. 结论 PMVECs中存在17种PDE基因表达,并有较高的基础酶活性.
关键词： 肺微血管内皮细胞 磷酸二酯酶 反转录-聚合酶链反应 高效液相色谱 大鼠 -
内皮素-1在烫伤大鼠脑血管损伤中的表达
目的 探讨内皮素-1(ET-1)在烫(烧)伤大鼠脑血管损伤的表达及其作用.方法 应用组织学方法观察8只烫伤大鼠脑基底动脉组织结构的变化;应用RT-PCR测定48只烫伤大鼠脑基底动脉ET-1 mRNA的表达;应用Western blotting分析48只烫伤大鼠脑基底动脉ET-1的表达;应用放射免疫分析检测48只烫伤大鼠脑基底动脉ET-1 水平的变化.结果 烫伤大鼠脑基底动脉呈现病理学组织结构变化;烫伤后3h大鼠脑基底动脉ET-1 mRNA表达较正常对照组开始升高,6h 达高峰;烫伤后6h大鼠脑基底动脉ET-1 表达较正常对照组增强,12h 达高峰;烫伤后各组大鼠脑基底动脉ET-1水平较正常对照组明显升高,6h 达高峰.结论 烫(烧)伤可诱发大鼠脑血管ET-1表达增加,增加表达的ET-1可能与烫(烧)伤大鼠脑血管损伤的病理发生有关.
