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番茄红素对二乙基亚硝胺损伤大鼠肝脏的保护作用
番茄红素是一种具有鲜红颜色的天然类胡萝卜素,具有优越的生理活性,如淬灭单线态氧、清除自由基、诱导细胞间连接通讯和调控肿瘤增殖等.番茄红素能够减缓动脉粥样硬化,防止冠心病的发生[1],能提高肝脏抗氧化能力,使机体免受氧化损伤[2].二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)是常见的诱癌剂,能产生自由基,造成机体氧化损伤,终可诱发癌症,对肝脏损伤尤其严重.本实验以DEN诱导大鼠氧化损伤,研究番茄红素对DEN所致损伤的影响.
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大蒜油对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌抑制作用的研究
目的 研究大蒜油对二乙基亚硝胺(N - nitrosodiethylamine,NDEA)诱发大鼠肝癌的抑制作用.方法 60只雄性Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组、NDEA模型组、大蒜油低、高剂量处理组,每组15只.NDEA模型组和大蒜油处理组均灌胃NDEA( 10 mg/kg),2个大蒜油处理组同时给予不同浓度的大蒜油灌胃(20和40 mg/kg),正常对照组给予等体积的玉米油灌胃.观察大鼠体重、肝重、肝脏系数、癌结节数和癌结节发生率的变化,同是对肝脏进行病理组织学检查；并检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的活性和甲胎蛋白(AFP)的含量.结果 与正常对照组相比,NDEA模型组大鼠体重明显降低,肝重和肝脏系数明显增加,血清ALT、AST、ALP和γ-GT的活性和AFP的含量均明显升高(P＜0.01)；与NDEA模型组相比,大蒜油处理组大鼠各项指标明显好转（P＜0.01或P＜0.05）.病理结果显示,与NDEA模型组相比,大蒜油低、高剂量组癌结节数和发生率明显降低,且癌细胞分化程度较高.结论 大蒜油对NDEA诱发大鼠肝癌形成具有明显的抑制作用.
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二乙基亚硝胺(DEN)诱发λ/lacZ转基因小鼠微核和基因突变实验研究
目的应用λ/lacZ转基因小鼠检测二乙基亚硝胺(DEN)诱发体内遗传毒性.方法小鼠腹腔注射DEN(25mg/kg),每周1次,连续4周.染毒48小时后检测外周血微核细胞率.末次染毒7天后处死动物,提取组织DNA,通过体外包装反应获得并测定肝脏、肺脏、膀胱lacZ基因突变频率.结果DEN诱发微核率与对照组无显著性差异,肝脏组织lacZ基因突变(MF)为268.4×10-6,是对照组的6.13倍,肺脏MF也明显高于对照,是其3.66倍,而膀胱组织MF则与对照无显著性差异.结论肝脏、肺脏均是DEN致突变的靶器官,但对其敏感度并不相同.
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白首乌苷对二乙基亚硝胺诱发实验性肝癌大鼠细胞因子产生的影响
目的:观察白首乌苷对二乙基亚硝胺诱发实验性肝癌模型大鼠细胞因子产生功能的影响.方法:二乙基亚硝胺诱发大鼠发生实验性肝癌后,应用不同剂量的白首乌苷进行治疗,观察其产生白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)和γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)的能力.结果:白首乌苷剂量在25mg/kg体质量时可增加大鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的能力；剂量在50mg/kg体质量时可增强大鼠脾脏淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的能力.结论:白首乌苷对二乙基亚硝胺诱发实验性肝癌大鼠细胞因子的产生具有明显的改善作用.
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黄芩苷对二乙基亚硝胺诱发肝癌前病变小鼠肝脏功能的影响
目的:考察黄芩苷对二乙基亚硝胺(DEN)诱发肝癌前病变小鼠肝脏功能的影响.方法:采用DEN腹腔注射诱发肝癌前病变小鼠模型,通过比较小鼠肝脏病理切片和血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷胱甘肽-S-转移酶和碱性磷酸酶水平考察黄芩苷灌胃给药对模型小鼠肝脏功能的影响.结果:DEN能够严重损坏小鼠的肝脏功能,病理切片显示其出现肝硬化、纤维增生分割肝小叶、肝细胞变质、异型性倾向、核内包涵体等异常结构,并有大量巨噬细胞浸润,同时血清中肝功酶活性显著升高(P＜0.05);黄芩苷给药组纤维增生少,未能完全分割肝小叶,肝细胞变质等少见,血清肝功酶的水平较模型对照组有所降低(P＜0.05).结论:黄芩苷对于于DEN诱发的肝癌前病变小鼠肝功能有一定的保护作用.
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抑癌方、活血方对实验性肝癌大鼠免疫功能的作用
为探讨抑癌扶正行气中药及活血化瘀中药治疗实验性大鼠肝癌的机理,我们采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发实验性大鼠肝癌,观察抑癌扶正行气方(简称抑癌方)和活血化瘀方(简称活血方)对实验性大鼠肝癌的治疗效果,并对其免疫调节作用和抗肝癌机理进行了研究.结果表明:抑癌方和活血方均可提高大鼠脾细胞IL-2的产生(P<0.01),且抑癌方效果优于活血方(P<0.01).两方均可使NK细胞活性增强(P<0.01),使大鼠血清sIL-2R降低(P<0.01),两方间无显著性差异(P>0.05).结论:抑癌方和活血方可调整和增强实验性肝癌大鼠机体免疫水平,对大鼠肝癌有一定的抑制作用.
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棉酚抗癌作用机理研究
本实验以二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠实验性肝癌为模型,通过肝细胞光镜结构、超微结构;肝脏组织分化酶、增殖酶;肝细胞核内AgNORs计数;癌基因c-Myc及增殖细胞核抗原的表达等变化,探讨棉酚对大鼠实验性肝癌癌前病变的预防和治疗作用.结果:1.DEN诱癌过程中有癌基因c-Myc的参与;2.癌变过程中伴有与细胞增殖有关的酶活性增高和与细胞分化有关的酶活性降低;3.棉酚可能是通过直接作用于细胞器,抑制癌变细胞的细胞周期调控因子的表达,抑制rDNA的转录活性,以及抑制细胞增殖酶活性和增强细胞分化酶活性等多个环节来抑制细胞增殖,促进细胞分化,从而起到抗癌的作用.
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DEN诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变
目的:揭示肝癌诱发过程中肝组织基因表达谱的演变,为中医药防治原发性肝癌提供参考.方法:采用DEN诱发大鼠肝癌,分别于诱癌的第4周、8周、16周、20周(肝癌形成)切取肝(合肝癌)组织,常规提取RNA,Affymetrix Rat 230A GeneChip及技术检测大鼠肝组织基因表达的差异和演变.结果:在芯片的15710个基因中,正常组有9225个基因表达,诱癌4周表达增至9396个,8周增至9872个,16周增至10496个,20周有10420个.在肝癌诱发过程中,存在大量基因表达的消长以及高表达基因数的增加,其中部分已知基因的结果.结论:DEN诱发大鼠肝癌过程中基因组变化是十分复杂的,而且文献追踪表明,国内外对在这些基因的功能及其与肝癌发生、发展的关系大多不明确.因此,如何逐一找到那些起着关键作用的基因,进一步阐释其在肝癌的发生、发展和转归中的作用,及其与中医证候演变和相应治法的关系,是今后中医基础理论实验研究的重要方向.
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肝郁脾虚因素促进DEN诱发大鼠实验性肝癌的研究
目的:观察肝郁脾虚因素刺激对二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠实验性肝癌发生及免疫功能的影响.方法:建立大鼠实验性肝癌肝郁脾虚证动物模型.大鼠给予诱癌剂(DEN70mg/kg灌胃,每周1次,连续8周),同时给予肝郁脾虚(束缚加饮食失节法)刺激至第19周,断头处死,做病理切片,HE染色,镜下观察肝组织病变;取肝组织用流式细胞术检测DNA含量;测定脾脏T、B淋巴细胞转化率和腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力.结果:肝郁脾虚因素可明显降低该模型大鼠的体重和免疫功能,并可使肝细胞DNA含量发生异常变化.结论:肝郁脾虚因素可促进DEN诱发大鼠实验性肝癌的发生发展.
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斯钙素1基因在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌发生中的表达
目的 检测哺乳动物斯钙素1(STC1) mRNA和STC1蛋白在二乙基亚硝胺(DENA)诱导大鼠肝癌发生不同阶段的表达水平. 方法 选取80只SD大鼠,随机分为两组,实验组按DENA 70 mg/kg体重灌胃,诱导大鼠肝癌模型,对照组等量蒸馏水灌胃.采用组织病理学、RT-PCR和Western blotting技术分析大鼠肝组织中的STC1基因和蛋白表达水平. 结果只有在DENA诱导的大鼠肝癌组织内才有STC1 mRNA表达和STC1分泌,并且与肝癌发生进程具有相关性. 结论 STC1基因表达和STC1分泌水平与肝细胞癌变具有相关性,可望成为用于肝癌诊断的分子标记物.
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实验性肝癌前期病变的研究及中药复方861对其的影响
目的研究肝癌前期病变有关指标的表达和中药复方861对癌前期病变形成过程的影响.方法以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前期病变,以复方861对诱癌过程干预,利用免疫组化、蛋白质印迹(Western-blotting)法分别检测胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-P)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果免疫组化染色结果示第6周时见GST-P阳性细胞,第8周开始普遍见GST-P结节.PCNA免疫组化结果示,第6周开始有阳性细胞表达,部分GST-P阳性结节内PCNA阳性细胞较多.Western-blotting结果示GST-P从诱癌第6周开始有阳性表达,造模组GST-P阳性表达比同期干预组表达量大.结论PCNA标识的GST-P阳性的细胞是早期癌前期病变的有效标志.复方861可抑制癌前期病变的进程.
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PINCH1和F-actin蛋白在诱发性肝癌发生过程中的变化特点
目的 观察诱发大鼠肝癌过程中PINCH1和F-actin蛋白表达特点,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用.方法 利用二乙基亚硝胺(DEN)制备诱发性肝癌动物模型,采用免疫组织化学方法检测PINCH1和F-actin蛋白在对照组、模型Ⅰ组(6周)、模型Ⅱ组(14周)、模型Ⅲ组(22周)大鼠肝脏中表达的差异.结果 在对照组大鼠肝脏中少见PINCH1和F-actin蛋白表达阳性的细胞,其在模型Ⅰ组(6周)中主要表达在肝小叶周边的损伤区的周围.在模型Ⅱ组(14周)分布于门管区、肝小叶的周边及非典型增生结节内,其中PINCH1位于非典型增生结节内居多,而F-actin主要分布于基质细胞及细胞外基质中.在模型Ⅲ组(22周),PINCH1蛋白在肝癌结节周边区域呈过表达,癌周组织中也可见PINCH1蛋白表达阳性的细胞;F-actin主要表达在癌周的肝细胞、基质细胞细胞和细胞外基质中.模型组(22周)的PINCH1和F-actin蛋白表达的平均光密度值均高于其他各组.结论 在诱发肝癌发生过程中PINCH1和F-actin蛋白表达异常,可能参与了肝癌发生发展过程.
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Shh、Ptch、Glil与CyclinB1-CDK1在肝癌发生发展过程中的改变
目的 观察大鼠诱发肝癌过程中shh信号通路相关蛋白及细胞周期蛋白的表达变化,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用.方法 利用二乙基亚硝胺(DEN)制备诱发性大鼠肝癌模型,通过HE染色观察肝组织的形态学变化,应用免疫组织化学方法检测Shh、Ptch、Gli1、CyclinB1、CDk1蛋白在诱发性肝癌发生过程中的表达变化.结果 根据HE染色结果将实验动物分为正常对照组、肝细胞损伤期、肝细胞增生一硬化期和肝细胞癌变期.shh、Ptch、Gli1蛋白阳性表达细胞主要分布在增生结节、癌结节、小叶间胆管上皮细胞和癌周组织中,其阳性表达率均随肝癌发生发展过程逐渐增高的趋势:CyclinB1和CDK1阳性表达的细胞主要分布于门管区、肝小叶的周边及癌结节内,在肝细胞增生一硬化期和肝细胞癌变期大鼠肝组织中表达均高于正常对照组.结论 Shh信号通路被激活后,可通过影响CyclinB1和CDK1蛋白的表达促进细胞G2/M期转变,完成有丝分裂,导致细胞失控性增殖,促进肝癌的发生发展.
关键词： 肝肿瘤 二乙基亚硝胺 细胞周期蛋白B 细胞周期蛋白质依赖激酶类 Shh信号通路 -
CK19及C-kit蛋白在DEN诱发大鼠肝癌过程中的表达及意义
目的：观察在大鼠诱发性肝癌中肝脏组织中细胞角质素19（CK19）及C-kit（CD117）蛋白的表达，探讨其在肝癌发生发展过程中的意义。方法利用二乙基亚硝胺（DEN）制备诱发性大鼠肝癌模型，在此模型的基础上，HE染色观察肝组织的形态学变化，免疫组织化学法检测CK19及 C-kit 蛋白的表达。结果根据肝组织形态学变化将诱癌过程分为肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期。胆管上皮、卵圆细胞、癌周组织中的细胞和少量癌细胞上均可见 CK19蛋白阳性表达；C-kit蛋白表达在卵圆细胞，并随着诱癌的进行出现向肝小叶内穿插的现象。结论 CK19及C-kit蛋白标记的卵圆细胞是大鼠DEN诱发性肝癌发生发展的启动细胞。
关键词： 肝肿瘤 原癌基因蛋白质C-kit 二乙基亚硝胺 CK19蛋白 卵圆细胞 -
DEN诱导大鼠肝癌形成中miR-199a的表达机制及健脾解毒法的干预作用
目的:探讨中药复方健脾解毒方对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌的预防作用及其调控miR-199a的表达机制.方法:♂Wistar大鼠,随机分为正常组(n=25)、模型组(n=40)及中药预防组(n=40).除正常组外,其他组在1-12wk用含DEN 80 mg/L的饮水[mg/(kg·d)]以诱癌,中药组同时给予含生药1.75 g/mL的健脾解毒方灌胃(10 mL/kg),正常组给予10 mL/kg生理盐水灌胃,每日1次,共12wk.于4、8、12、16 wk时相点,各组随机取5只大鼠处死取肝,20 wk将剩余大鼠全部处死取肝,观察肝脏外观,计算死亡率和腹水生成率,比较肝脾指数,肝组织进行HE染色,应用Realtime PCR检测肝组织miR-199a的表达.结果:在20 wk实验结束时,正常大鼠无死亡,而模型大鼠死亡率为42.5%(17/40),预防组死亡率为17.5%(7/40),16.20 wk时模型组腹水发生率为87.5%(7/8),预防组为44.4%(8/18),与模型组有差异性(P<0.05).正常组没有肿瘤形成,模型组和预防组在16 wk后成瘤率均为100%.16 wk模型组肝癌Ⅲ级发生率为100%(5/5),而预防组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肝癌发生率分别为40%(2/5)、40%(2/5)及20%(1/5),两组比较有差异(P<0.05).与模型组比较,中药预防组有显著降低肝脾指数的作用(均P<0.01).PCR结果显示.模型组肝组织miR-199a较正常组明显上调,中药预防组除16 wk外均有显著下调miR-199a表达的作用(均P<0.01).结论:健脾解毒方有预防DEN诱导大鼠肝癌发生的作用,其机制可能部分与下调miR-199a的表达有关.
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二乙基亚硝胺诱发肝癌前病变大鼠模型的建立
目的:研究二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的时效关系与量效关系.方法:Wistar♂大鼠100只,体质量均衡随机分5组；每84 h 1次分别腹腔注射二乙基亚硝胺0、25、50、75、100 mg/kg造模.每组体质量排序分10小组,年龄配对；造模时程短0d,间隔14d延长,长126 d,灌注固定肝脏.常规石蜡包埋,6 μm切片,HE染色,观察病变性质后显微照相；使用Image-Pro Plus软件,分别形态计量10、20、40倍物镜下汇管区(R1)、肝索(R2)、肝细胞核(R3)的体积构成比,观察每10个高倍镜视野下的核分裂像；计算各动物异型性指数[Ei=(1-R1)-1·(R3)·(R2)-1].Prism 4软件回归“二乙基亚硝胺导致异型性指数”的时效曲线及曲线下面积,进而导致曲线下面积的量效关系.结果:以异型性指数(肝细胞核/浆体积比校正值),回归0、25、50、75、100 mg/kg二乙基亚硝胺造模的半效时程(95％CI)分别为70 347(0-)、1 734(937-3 211)、1 536(948-2 490)、1 530(890-2 632)、1 183(955-1 466)h,曲线下面积分别为0.0064、0.0084、0.0123、0.0165、0.0167[异型性指数·log(h)].以曲线下面积,回归二乙基亚硝胺诱发肝细胞癌前病变的半效剂量为48.255mg/kg.50.000mg/kg造模各时程的异型性指数与核分裂像总数之间呈直线正相关(y=0.0023x-0.0056,r=0.9217,n=10,P＜0.01).结论:以异型性指数为指标,每84 h腹腔注射1次二乙基亚硝胺,诱发♂大鼠肝细胞癌前病变的佳造模剂量为48.255 mg/kg(约50.000mg/kg),佳造模累积连续时程为64 d.核分裂像计数验证了异型性指数的临床预警价值.
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柴胡皂甙D对DEN致大鼠肝癌免疫功能的影响
目的: 观察柴胡皂甙D(saikosaponin-d, SSd)对二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)致大鼠肝癌免疫功能的影响, 并探讨其与SSd抗肝肿瘤作用的关系.方法: 清洁级♂SD大鼠90只, 平均体质量248.18±12.32 g, 随机分为5组: 模型组(n =20), 对照组(n=10)及SSd大、中、小剂量治疗组(均n=20).除对照组给予等量生理盐水灌胃外, 其余各组大鼠均给予2 mg/L DEN灌胃, 按体质量10 mg/kg给药, 每周5次, 同时各治疗组每天给予不同浓度SSd(2.0、1.5、1.0 mg/kg)腹腔注射, 至16 wk停药, 麻醉后处死大鼠.HE染色观察实验大鼠肝组织病理学结构的改变, 应用流式细胞仪测定大鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+ CD4+%、CD3+ CD8+%及CD3+CD4+/CD3+ CD8+比值).结果: SSd各治疗组大鼠癌结节数及灶的大小均小于模型组.镜下单纯造模组癌细胞呈多形性, 异形性明显, Edmondson分级多数属于Ⅲ级;相反, SSd各干预组癌细胞分化程度高,异型性较低, 分级多为Ⅰ-Ⅱ级;肝癌模型组与正常对照组T淋巴细胞亚群比较CD4+、CD4+/CD8+明显下降, CD8+上升, 差异有统计学意义(33.56%±4.16% vs 45.50%±4.03%;1.06±0.56 vs 1.93±0.28;30.62%±3.65% vs 22.88%±3.15%;均P<0.05);而SSd各组与肝癌模型组T淋巴细胞亚群比较CD4+、CD4+/CD8+明显回升, CD8+下降, 差异有统计学意义, 尤其以SSd大剂量组明显(39.06%±3.98% vs 33.56%±4.16%;1.55±0.29 vs 1.06±0.56;18.99%±3.09% vs 30.62%±3.65%;均P<0.05).结论: SSd对DEN诱发大鼠肝癌形成有一定的免疫保护作用.
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二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因
目的:首次大范围地观察二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌组织基因表达的差异,探索DEN诱发肝癌的分子机制.方法:DEN诱导大鼠肝癌,常规抽提和纯化RNA,采用Affymetrix Rat 230A GeneChip及技术比较肝癌组织与正常大鼠肝组织基因表达的差异.结果:在芯片的15 710个基因中,肝癌有84.54%的基因阳性表达,肝癌基因表达在正常肝脏5倍以上的有509个,其中325个为EST片段,已知基因184个,其中的168个基因可以检索到有关文献的报道.在这168个基因中,有100个基因被发现与肿瘤有关,其中有36个与肝癌有关;有4个基因与肝脏有关;另有64个基因与肿瘤和肝脏无关.结论:DEN诱发大鼠肝癌的后基因组变化中168个基因值得优先关注.
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细胞凋亡蛋白在肝癌发生过程中的作用
目的:进-步探讨促凋亡蛋白Bid在肝癌发生、发展过程中的作用.方法:应用基因毒性生化学剂二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)制备肝癌动物模型,通过阻断肝细胞凋亡信号传导途径,观察肝癌发生过程中肝细胞的增生指数(BrdU LI)与凋亡比率(AI)及与肿瘤发生的关系.结果:(1)在DEN用药后的第3 d和第10 d,野生型小鼠肝细胞BrdU标记指数和凋亡细胞百分比分别明显高于Bid缺陷小鼠(P＜0.05).(2)在DEN用药后的第4 mo,野生型小鼠肝内损伤性结节的数量和表面积明显多于Bid缺陷小鼠,二者间具有统计学意义(P＜0.001).结论:Bid缺陷小鼠对DEN诱导的肝癌具有明显的抵抗作用,这一作用可能与早期肝细胞凋亡有关.
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清热活血健脾中药对大鼠肝癌基因转录差异的调整
目的:观察中药抑癌扶正行气活血方(全方)及其不同治法的拆方:清热方、活血方、健脾方对肝癌大鼠的作用和对肝组织基因转录的整体调节作用.方法:采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌,设正常组、模型组、不同中药组及FT-207组对照,分别观察各组大鼠生存率、肝、体、肝/体及肝组织的病理、甲胎蛋白(AFP)免疫组化变化;以及采用DDPCR技术显示正常肝组织与模型组肝癌组织中呈差异转录的cDNA片段,Northern blot验证这些cDNA片段在各组中转录的差异,并将呈差异转录的cDNA片段进行克隆与测序.结果:全方其及拆方均能不同程度地改善肝癌大鼠的一般情况,提高大鼠的生存率.各拆方中以清热组与活血组为优;全方其及拆方均能不同程度地抑制肿瘤的生长及肝脏AFP的合成,其中以全方组与清热组为优;采用DDPCR结合Northern blot筛选出在各组中呈显著差异转录的9个阳性cDNA片段,经与Genbank比较4个为新的基因,且这9个基因在肝癌发生与转归中的作用至今未见报道;全方及其拆方对这些基因的转录水平有不同程度的调节作用,其中DD29下调57-78%,DD11 、DD25也有下调至60%和78%,使基因转录水平接近正常肝组织.结论:全方及其不同治法的拆方中药对大鼠肝癌具有直接治疗作用,能不同程度地广泛地调控肝组织(含肝癌组织)有关基因的转录水平.
