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湖北钉螺扩增片段长度多态性分子标记遗传多样性研究的合理样本量与分子位点数
目的探讨用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记研究湖北钉螺遗传多样性的合理样本量与分子位点数.方法选取湖南省岳阳市遗传变异较大的肋壳钉螺为研究材料,用AFLP方法对钉螺基因组DNA进行扩增,然后分析湖北钉螺样本量和分子位点数与遗传变异信息可靠性的关系.结果湖北钉螺样本量和分子位点数与遗传多样性信息的可靠性之间存在明显的关系.当样本量低于7只时,AFLP总位点数、多态位点数、多态位点频率、Nei's基因多样性指数和Shnnon's信息指数变化很大,而当样本量超过30只时,这些指标值的变化趋于平稳.当AFLP分子位点数低于128时,多态位点频率、Nei's基因多样性指数、Shannon's信息指数以及这两个指数的标准差变化相当剧烈,当分子位点数超过338时,这些指标值的变化趋于稳定.结论在用AFLP分子标记技术研究湖北钉螺的遗传多样性时,每个钉螺种群内的样本量好不应低于30只,用于研究分析的分子位点数好不低于338个.
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微卫星锚定PCR分析19个湖北钉螺种群之间的遗传变异关系
目的 探讨湖北钉螺种群间的遗传变异关系.方法 采用微卫星锚定PCR分子标记技术对来自中国大陆8个省的19个种群钉螺基因组DNA进行扩增,分析钉螺各种群间的遗传变异并对钉螺种群进行聚类分析.结果 19个钉螺种群间的遗传距离D在0～0.73之间,平均遗传距离D为0.22±0.013.19个钉螺种群被聚成4类,一类包括分布在长江中下游流域(湖南、湖北、江西、安徽、江苏)的16个钉螺种群;广西宜州、福建福清和云南大理的钉螺种群分别单独成一类.结论 目前分布在中国大陆的湖北钉螺可能分为4个亚种,即指名亚种、滇川亚种、福建亚种、广西亚种.
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25个湖北钉螺种群扩增片段长度多态性分子标记的遗传变异研究
目的 探讨湖北钉螺种群间的遗传变异及其程度.方法 采用扩增片段长度多态性分子标记技术对来自中国大陆10省的25个种群钉螺基因组DNA样品池进行扩增,分析钉螺各种群间的遗传变异并对钉螺种群进行聚类分析.结果 25个钉螺种群间的相似系数GSDICE在0.694～0.831之间,Nei无偏遗传一致性在0.635～0.799之间,遗传距离D在0.169～0.306之间,Nei无偏遗传距离在0.225～0.452之间,光壳钉螺种群间的遗传变异程度明显高于肋壳钉螺种群间的遗传变异程度(P＜0.01).25个钉螺种群被聚成3类,A类包括来自福建福清和广西宜州的光壳钉螺种群;B类包括来自四川西昌、普格、丹棱、蒲江、广汉和云南大理的光壳钉螺种群;C类则由其他来自长江中下游地区的17个钉螺种群组成.结论 在中国分布的湖北钉螺已发生较大的遗传变异,基因组水平上的钉螺种群聚类结果和其地理分布基本一致.
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湖北钉螺微卫星锚定PCR产物序列分析
目的 分析4个种群湖北钉螺中微卫星序列及其两侧序列的特点.方法 以(CA)8RY为引物对湖北钉螺基因组DNA进行微卫星锚定PCR(SSR-PCR)扩增,对全部159个扩增产物进行T克隆并测定其中82个片段的核苷酸序列.结果 SSR-PCR的扩增产物是湖北钉螺基因组DNA上的散在区域,不是微卫星序列,但扩增产物中含有微卫星序列,测序的82个片段中36个克隆片段含有微卫星序列.微卫星序列其侧翼序列有一定的保守性,同一个微卫星的侧翼序列多数情况下是相同的.(GA/CT)n、(TTAGGG/CCCTAA)n两类微卫星在4个钉螺种群中均有发现,(CAA)n仅在福建福清种群中发现,(TCTCTG)n仅在安徽贵池种群中发现,(GAA～TTC)n、(CAA/TTG)n、(CAT)n三种微卫星序列仅在四川普格种群中发现.结论 SSR-PCR扩增的不是微卫星,其结果的分析应当类似于随机扩增多态性DNA.因此SSR-PCR不能十分有效体现微卫星作为分子标记的优势,应当根据微卫星的侧翼序列设计针对微卫星的引物,对微卫星进行PCR扩增并进行分析.
关键词： 湖北钉螺 微卫星锚定聚合酶链反应 两翼序列 -
四川光壳钉螺微卫星遗传变异的小尺度空间自相关分析
目的 采用小尺度空间自相关分析方法对四川省普格县的湖北钉螺自然居群微卫星(SSR)遗传变异的空间结构进行分析,探讨湖北钉螺自然居群遗传变异的空间分布特征.方法 选用5对SSR引物对湖北钉螺基因组DNA进行扩增,选择频率在15%～85%的72个SSR等位基因,运用等样本对频率方法划分14个距离等级分别计算空间自相关系数Moran's I,.结果 5对SSR引物经PCR扩增共得到274个等位基因,SSR等位基因的平均多态信息量高达0.965,表现出很高的遗传多态性.钉螺种群中39个SSR等位基因的遗传变异存在一定程度的空间结构,表现为不同模式的正空间自相关.根据这39个等位基因在14个距离等级上的平均Moran's I值,可以发现随着距离增大正空间自相关性逐渐减小,但未发现表现为负空间自相关的距离等级和等位基因.结论 普格县湖北钉螺种群中SSR遗传变异的空间分布,表现为随着距离增加而减少的正空间自相关性.
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用RAPD技术对湖北钉螺遗传变异的研究
目的对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究,并为种下分类提供依据. 方法采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对中国9省17地的湖北钉螺进行PCR扩增,并根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳的带型,计算各地域株间的遗传距离,根据遗传距离绘制系统进化树. 结果各地域株标本PCR产物均呈多态性,其中台、闽与中国大陆其余地域株钉螺遗传距离为0.148 3～0.310 2;滇、川两个地域株间为0.139 5,此两株与长江中下游各地域株遗传距离达0.126 6～0.310 2,与闽、台株为0.1898～0.2235;湖区型与平原水网型湖北钉螺的遗传距离为0.058 9～0.187 2;山丘型与湖区型及平原水网型之间的遗传距离为0.132 6～0.310 2;湖北省内各地域株遗传距离为0.042 1～0.244 1. 结论应用RAPD技术为可将湖北钉螺分为6类:①闽、台地域株;②滇、川地域株;③湖北荆门、阳新、武汉、钟祥、沙市、石首、松滋(包括松滋河及庙河上下游的钉螺),赤壁(车埠)、赣、沪、皖地域株;④湖南地域株;⑤湖北应城地域株;⑥湖北赤壁(大田畈)地域株.
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微卫星锚定PCR研究湖北钉螺的遗传变异
目的对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究,并为其种及种下分类提供依据. 方法采用微卫星锚定PCR(SSR-PCR)技术对中国7省15地湖北钉螺基因组DNA进行PCR扩增,根据扩增产物,计算遗传距离(D),并构建系统进化树. 结果各地域标本PCR扩增产物均呈多态性,其中中国大陆与中国台湾湖北钉螺之间的遗传距离为0.351±0.048(0.263～0.445);中国大陆湖北钉螺山区型之间的遗传距离为0.043;湖区型之间的遗传距离为0.000～0.217;山区型与湖区型之间的遗传距离为0.182～0.308;来自湖北省境内9个地域的湖北钉螺,其遗传距离为0.000～0.167. 结论根据所采集的湖北钉螺标本和SSR-PCR的实验结果,认为中国大陆湖北钉螺在基因分类水平上至少可分为不同层次的4类:①云南洱源、四川天全为一类;②安徽贵池、湖南岳阳、湖北荆门、江西新建为一类;③湖北武汉、湖北钟祥、湖北阳新、湖北松滋、湖北沙市、湖北石首、湖北应城为一类;④湖北赤壁单独为一类.其中①与②③④在总体上可分为两大类,②③④又可再分为②③与④两类,②③还可再分为单独的两类.此外,台湾钉螺为单独的一类.
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安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺遗传差异性研究
目的 研究安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺的遗传差异性. 方法 采集宁国市有螺无病地区和芜湖市有螺有病地区的湖北钉螺,提取其头足部基因组DNA,用7条GC含量不同的随机引物进行RAPD扩增,根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳的DNA带型,比较两地湖北钉螺基因组DNA的遗传差异性,并计算其遗传距离. 结果 两地区湖北钉螺PCR产物呈多态性,扩增产物中除具有相同的DNA条带外,又具有各自独特的DNA条带,扩增片段共享度F值为0.603,DNA条带亮度也有不同.两地湖北钉螺遗传距离为0.387. 结论 安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺基因组DNA存在较大的遗传差异.
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天南星有效成分的杀螺活性分析
目的 研究天南星提取物的灭螺有效成分.方法 测试提取物作用后钉螺的死亡率.结果 天南星正丁醇提取物的灭螺活性强,其提取物100mg/L浓度处理2d,钉螺死亡率达76.67%,3d达100%;块茎的杀螺活性较地上部分强,如60mg/L浓度处理2d,地上部分和块茎正丁醇提取物对钉螺的致死率为13.33%和40.00%,处理4d后钉螺的死亡率分别为50.00%和100%.结论 天南星块茎正丁醇提取物可能是有效的灭螺活性成分.
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免疫刺激剂对湖北钉螺酚氧化酶活性的影响
目的 实验研究几种常见的免疫抑制剂与激动剂对湖北钉螺酚氧化酶活性的影响.方法 将实验钉螺置于4组免疫刺激剂植酸、维生素C、β-葡聚糖、脂多糖及去氯水对照组中浸泡60 min,去壳,取软体组织通过匀浆、离心分别获取粗制酶液,以邻苯二酚为底物用比色法测定各组酶活力,结果进行统计学分析.结果 对照组各时间段与0h间比较,差异均无统计学意义(F=2.10,P＞0.05);植酸和维生素浸泡后各时间段与对照组比较酚氧化酶(PO)活力下降(P＜0.05),随着时间的延长活力逐渐下降,β-葡聚糖和脂多糖处理后PO活力上升(P＜0.05),且随着时间的延长PO活力为逐渐上升.结论 免疫刺激剂植酸、维生素C会引起钉螺PO活力下降,而β-葡聚糖和脂多糖使PO升高.
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湖北钉螺的酶学研究方法及应用
随着钉螺酶学研究方法的进展和应用,不仅使钉螺的分类日臻完善,而且对钉螺与血吸虫相容性的研究以及改变生态环境制约钉螺的机制、化学和植物灭螺药物机制等方面的研究也起到大力推进作用.该文介绍了国内外用于钉螺酶学研究方法的发展历程,总结了多种酶学检测方法以及应用这些方法所获得的钉螺软体内酶的分布情况,并比较了不同酶学检测方法的优势所在,同时指出钉螺的酶学研究方法中还存在着一定的局限性,更多种类酶的显示方法还有待于探索.
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湖北钉螺中枢神经节研究概况
钉螺中枢神经节是研究药物或各种生物与理化因素对钉螺的影响及杀灭作用的重要观察指标.不同灭螺药物或影响因素对钉螺中枢神经节的细胞结构、生化指标和酶学特点等可产生不同影响,现就湖北钉螺中枢神经节的解剖方法、解剖形态、组织学结构及酶组织化学特点等研究进行综述.
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钉螺血淋巴细胞酸性磷酸酶活性的研究
目的为研究日本血吸虫幼虫与钉螺宿主的相容性与抵抗性机制提供基础资料.方法将解剖的钉螺软体组织经挤压法获取钉螺血淋巴液,以偶氮色素法染色后,光学显微镜下观察螺血淋巴细胞酸性磷酸酶(ACP)活性.结果在钉螺血淋巴细胞中的伸展性阿米巴细胞胞浆中可见呈棕色颗粒的ACP阳性反应物,而圆形阿米巴细胞胞浆中未见呈棕色颗粒的ACP阳性反应物.结论钉螺血淋巴细胞中的伸展性阿米巴细胞含ACP.
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湖北钉螺体内溶菌酶活力及抑菌作用
目的 探讨湖北钉螺体内溶菌酶活力及其抑菌效果.方法 将钉螺软体组织匀浆后,采用浸提法用Tris-HCl-TritonX-114缓冲溶液浸提24 h,10 000×g离心10 min;取上清,37℃水浴15 min,2000×g离心10 min;取沉淀,置于超滤离心管中[截留相对分子质量(Mr)=3000)],在4℃下5000 ×g离心30 min,使之浓缩,即得浓缩溶菌酶.采用二喹啉甲酸(BCA)法测定溶菌酶蛋白质含量,浊度法测定溶菌酶的活力,琼脂扩散(K-B)法检查溶菌酶对溶壁微球菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白色念珠菌的抑菌作用.结果 湖北钉螺体内存在溶菌酶,浓缩酶中蛋白质含量为3.428 g/L,活力为(760±120)×103 U/L,总活力为(1520±240)×103 U/L,比活力为(221.70±35.00)U/mg.加入浓缩溶菌酶后,溶壁微球菌、痢疾志贺菌出现抑菌圈,抑菌环直径分别为10～ 12、12～15 mm,生理盐水对照未见抑菌圈.金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白色念珠菌均未见抑菌圈.结论 缓冲液浸提法能从钉螺软体组织中分离出具有活力溶菌酶,溶菌酶对溶壁微球菌、痢疾志贺菌有抑菌作用,而对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌无抑菌作用.
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分子系统地理学及其在湖北钉螺中的研究进展
分子系统地理学是20世纪70年代中期伴随着对线粒体DNA的认识而开始发展的一门学科,为湖北钉螺的群体遗传分化研究提供了新的手段和思路.该文对分子地理系统学的发展历程和研究方法,以及湖北钉螺的分子系统地理学研究进展进行综述,并对将来的研究方向提出建议.
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氯代水杨胺缓释颗粒剂杀灭钉螺效果评价
目的 评价氯代水杨胺缓释颗粒剂(LDS-SRG)杀灭湖北钉螺(Oncomelania hupensis)的效果.方法 将5％、10％ LDS-SRG分别配置成有效浓度/剂量为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/L(浸杀法)或g/m2(喷撒法)的溶液或药剂.实验室浸杀试验中,各浓度分别投螺袋3包,每包30只钉螺,分别于24、48、72 h各取1包螺袋,计数试验螺数和死亡螺数,计算钉螺死亡率.实验室喷撒试验中,每剂量投放钉螺约200只,于施药后3、7d各取约50只钉螺,施药后14d取其余全部钉螺,分别计算钉螺死亡率.现场浸杀试验中,LDS-SRG浓度为0.4、0.8、1.6 g/m3,每浓度投螺袋6包,每包30只钉螺,分别于24、48、72 h各取2包螺袋,计算钉螺死亡率.现场喷撒试验中,LDS-SRG剂量为0.8、1.6、3.2 g/m2,每剂量施药于3个有螺沟渠小区(每小区约100 m2),于施药后3、7和14 d,每小区抽取10框钉螺,计算钉螺死亡率.全部试验均设50％氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂(WPN) 1.0 mg/L或g/m2或g/m3药物对照组和空白对照组. 结果 实验室浸杀试验结果显示,5％ LDS-SRG 0.1～6.4 mg/L浸杀72 h,以及1.6～6.4 mg/L浸杀48 h,钉螺死亡率均为100％,24、48、72 h半数致死浓度(LC50)分别为0.70、0.01、0.01 mg/L;10％ LDS-SRG 0.1～6.4 mg/L浸杀72 h,以及0.2～6.4 mg/L浸杀48 h,钉螺死亡率均为100％,24、48、72 h LC50分别为0.15、0.01、0.01 mg/L.实验室喷撒试验结果显示,5％ LDS-SRG 1.6、6.4 g/m2施药后7d,以及3.2、6.4 g/m2施药后14 d,钉螺死亡率均＞95％,其3、7、14 d半数致死剂量(LD50)分别为0.06、0.16、0.18 g/m2;10％ LDS-SRG 1.6 g/m2施药后14 d,以及6.4 g/m2施药后7d,钉螺死亡率均＞95％,其3、7、14 d LD50分别为3.29、0.75、0.16 g/m2;5％ LDS-SRG各剂量处理不同时间的钉螺死亡率均高于药物对照组(P＜0.05).现场浸杀试验结果显示,5％、10％ LDS-SRG 1.6 g/m3浸杀72 h,钉螺死亡率分别为96.43％和98.21％,与药物对照组的100％相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).现场喷撒试验结果显不,5％、10％ LDS-SRG 3.2 g/m2施药后3、7、14 d,钉螺死亡率分别为93.99％、91.18％、86.48％和94.95％、93.50％、85.43％,均高于相应药物对照组的82.83％、72.38％、48.38％ (P＜0.05);5％ LDS-SRG0.8 g/m2现场喷撒14d和1.6 g/m2现场喷撒3d,钉螺死亡率为66.51％和84.61％,均高于10％ LDS-SRG的20.13％和43.06％ (P＜0.05). 结论 5％、10％LDS-SRG分别采用浸杀法和喷撒法灭螺,均达到农药登记用杀钉螺剂药效评价指标要求.
关键词： 氯代水杨胺缓释颗粒剂 灭螺效果 血吸虫病 效果评价 湖北钉螺 -
基于微卫星DNA标记的山东微山湖区放养钉螺遗传结构分析
目的 分析在山东微山湖地区长期放养的湖北钉螺(Oncomelania hupensis)群体与其来源地江苏省长江江滩钉螺群体之间的基因差异. 方法 收集江苏省扬州市江都区、仪征市和丹阳市、南京市六合区的长江钉螺以及山东省济宁市微山湖独山岛的钉螺.微山湖区放养的钉螺来自于扬州市江都区,放养时间为10年(至2014年).选择A18、C22、T4-33、T6-17等4对微卫星位点对钉螺群体进行PCR扩增,分析各钉螺群体的等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)和群体间遗传差异平均数等指标,并进行分子变异方差分析(AMOVA),用非加权组平均法(UPGMA)和邻接法(NJ)构建系统进化树描述群体遗传分化及聚类情况.使用Mantel检验探讨遗传距离与地理距离的相关性. 结果 本研究收集5个钉螺群体共103只钉螺.江都、仪征、丹阳、六合、微山湖群体的Na分别为7.50、12.50、10.00、11.50和12.75;Ho分别为0.16、0.27、0.17、0.30和0.22;He分别为0.81、0.91、0.84、0.90和0.92.微山湖群体的3个遗传多样性指标均在较高水平,提示有较好的遗传多样性,但与其他群体差异无统计学意义(P＞0.05).微山湖与江都钉螺群体间遗传差异平均数小(0.79),丹阳群体与其他群体之间差异较大,为0.87 ～0.97.AMOVA分析的遗传变异主要来源于钉螺个体间(占92.50％).NJ和UPGMA系统进化树显示,江都和微山湖的钉螺群体聚为一支,仪征和六合的钉螺群体聚为一支,丹阳钉螺群体与其他4个群体聚为一支.Mantel检验显示遗传距离与地理距离没有相关性. 结论 江苏省长江钉螺群体与微山湖钉螺群体基因多样性均较高,微山湖地区放养的钉螺与来源地的长江钉螺群体尚未出现明显遗传分化.
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氯代水杨胺缓释颗粒剂的制备及其杀螺效果
目的 研究5％和10％氯代水杨胺缓释颗粒剂(LDS-SRG)的制备方法及其杀螺效果. 方法 筛选载体、表面活性剂、黏合剂、消泡剂、润滑剂,制备5％和10％的LDS-SRG.对其堆密度、水分含量、休止角、临界相对湿度、热贮稳定性和释放速度进行测定.在实验室条件下以剂量1.6 g/m2(喷撒法)测试LDS-SRG的杀螺效果,设置50％氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂(WPN) 1.0 g/m2药物对照组和空白对照组(脱氯水),分别计算施药后3、7、14d钉螺的死亡率. 结果 制备的5％和10％的LDS-SRG均为红褐色,流动性良好;其堆密度分别为0.655 g/ml和0.594 g/ml;水分含量分别为1.15％和1.28％;休止角分别为39.8.和39.7.;临界相对湿度分别为64.98％和61.63％;热贮稳定性均良好.释放曲线表明,5％、10％的LDS-SRG第1～9天均平稳释放,5％ LDS-SRG释放速度大于10％ LDS-SRG;药物快速释放分别出现在第10天和第15天;并分别在第14天和第20天逐步趋于平稳.实验室喷撒结果显示,5％ LDS-SRG 1.6 g/m2施药后7d、10％ LDS-SRG 1.6 g/m2施药后14d,钉螺的死亡率均＞95％,且均高于50％ WPN 1.0 g/m2对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 5％和10％的LDS-SRG经实验室测试达到缓释效果,采用喷撒法灭螺,均达到农药登记用杀钉螺剂药效评价指标要求.
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应用微卫星DNA标记探讨我国长江中下游地区湖北钉螺群体遗传结构
目的 应用微卫星DNA分子标志分析中国长江中下游地区湖北钉螺群体的遗传结构. 方法 利用6对微卫星DNA引物,对采集自湖沼型血吸虫病流行区的湖南汉寿县、湖北阳新县、江西星子县、安徽当涂县和江苏扬州邗江区的湖北钉螺的P84、T5-13、T5-11、T4-22、T6-27和P82等6个位点进行荧光标记通用引物PCR扩增.每个采集点采集20～50个钉螺标本,共165个.统计分析各群体的等位基因数(Na)、近交系数(FIS)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)、群体间的遗传分化系数(FST)和遗传距离,根据遗传距离进行聚类分析,并进行分子变异方差分析(AMOVA). 结果 5个湖北钉螺群体在6个微卫星位点等位基因数范围为3～33,平均为15.833.群体的平均He和Ho范围分别为0.600～0.883和0.308～0.759,两者在湖北群体高,在江苏群体低.群体的FIS范围为0.143～0.539.成对群体间的FST范围为0.0006～0.0531,由于FST值较小,提示群体间未出现明显遗传分化.各群体的平均PIC为0.511～0.850,除江苏群体外,均为高度多态.分级AMOVA结算结果显示,变异主要存在于个体间,占总变异的95.2％.聚类分析结果显示,安徽群体与江苏群体首先聚为一支,然后依次同湖南、江西、湖北群体聚在一起. 结论 湖北钉螺多样性较为丰富;聚类分析结果符合湖北钉螺的地理分布格局；5个群体之间遗传差异较小,微卫星DNA的变异主要存在个体间.
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湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长基因克隆、表达与蛋白活性分析
目的 克隆湖北钉螺(Oncomelania hupensis)硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)全长基因cDNA,并分析其表达蛋白的抗氧化活性. 方法 抽提人工饲养的阴性湖北钉螺总RNA,采用逆转录PCR方法扩增TPx基因片段.使用快速扩增cDNA末端法(RACE)扩增TPx基因,获得全长基因cDNA,与质粒pGEM-Teasy连接后,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选、测序,并进行生物信息学分析.克隆质粒pGEM-Teasy/TPx和表达载体pET28a经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET28a/TPx,转入E.coli BL21 (DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,通过组蛋白标签镍离子(Ni-NTA)层析柱分离纯化可溶性蛋白.在体外过氧化氢(H2O2)还原试验中,分别加入不同浓度的TPx重组蛋白(10、20、30、40和50μg/ml),各浓度均设二硫苏糖醇(DTT)平行对照,计算H2O2清除率.在DNA超螺旋保护试验中,分别加入2.5、5.0和10 μg/ml重组蛋白,观察其对DNA超螺旋结构的保护作用. 结果 TPx全长基因cDNA为992 bp,开放阅读框(ORF)为747 bp,GenBank登录号为JN831437,编码249个氨基酸,预期蛋白相对分子质量(Mr)为27000.重组质粒pET28a/TPx构建成功,经诱导表达和纯化后获得了可溶性重组蛋白.SDS-PAGE结果显示,Mr为27000.体外H2O2还原试验结果显示,含有DTT的反应体系H2O2清除率均显著高于不含DTT的体系(均P＜0.05),各个浓度组间差异无统计学意义(均P＞0.05).DNA超螺旋保护试验结果显示,5.0μg/ml组保护效果优于2.5 μg/ml组,但5.0μg/ml组和10 μg/ml组的保护效果差异不明显.结论 获得湖北钉螺TPx全长基因cDNA,且重组表达蛋白具有一定抗氧化功能.
关键词： 湖北钉螺 硫氧还蛋白过氧化物酶 克隆 表达
