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肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立
目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.
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HBV共价闭合环状DNA Real-time PCR检测方法比较
目的 比较HBV共价闭合环状DNA (Covalently closed circular DNA,cccDNA) Real-time PCR检测方法.方法 选择文献中常用的普通Taq-Man探针及Taq-Man MGB探针两种检测方法,合成引物及探针,制备质粒标准品,提取乙肝患者血清及肝组织标本HBV DNA,分别用质粒安全ATP依赖的DNA酶(Plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)酶切,进行敏感性、特异性及重复性检测验证.结果 两种检测方法扩增质粒标准品均有良好线性关系(R20.989和0.976),重复性良好(CV＜4％);检测PSAD酶切前后质粒、血清及肝组织HBV cccDNA均有良好特异性;检测相同浓度样品时普通Taq-Man探针Ct值较Taq-Man MGB探针略低.结论 两种方法均可用于HBV cccDNA检测,本实验所用的普通Taq-Man探针较Taq-Man MGB探针敏感性略高;MGB探针本底更低.实际工作中可根据需求选择适宜的探针.
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套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBV cccDNA
目的:建立套式聚合酶链反应法(nPCR)检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA).方法:根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计两套相对保守的引物,建立HBV cccDNA套式PCR,并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA.结果:该法检测200例慢性乙型肝炎患者,HBV cccDNA阳性率为60%.结论:套式PCR法简便、灵敏,可用于测定PBMC中HBV cccDNA.
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过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)调控HBV微染色体重塑与病毒复制
目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARo)是否参与调控乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)微染色体重塑与病毒复制.方法:HepG2细胞单独转染、共转染线性HBV单体与PPARα表达或PPARα沉默载体;Southern blot检测转染细胞质内HBV核心颗粒DNA;实时定量PCR定量检测细胞质HBV核心颗粒DNA及细胞核内HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)水平;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测转染细胞上清中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg);染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)检测与cccDNA结合的PPARα、组蛋白和染色质修饰酶.结果:与单独转染线性HBV单体相比,共转染PPARα增加了PPARα与HBV cccDNA的结合,增加了HBV开环DNA(open circular DNA,OC DNA)及HBsAg和HBeAg水平,同时也增加了cccDNA微染色质中组蛋白H3和H4的乙酰化水平及乙酰转移酶p300的水平;共转染PPARo沉默载体则有相反的结果.结论:PPARα能直接与cccDNA结合并有助于乙酰转移酶p300募集到cccDNA上,从而调控HBV微染色质的表观遗传学和HBV复制.这一发现对HBV与宿主转录因子间相互作用的相关分子机制提供了新的机制.
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HBV cccDNA检测临床应用研究进展
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA, HBVcccDNA)是嗜肝病毒复制过程中产生的一种重要复制中间体,在宿主细胞核内积聚,形成HBV cccDNA池,半衰期长,现有抗病毒药物不能清除,是宿主肝细胞持续感染和抗病毒治疗后产生耐受和停药后复发的关键,受到病毒包膜蛋白及免疫细胞因子等一系列因素的精确调控.
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套式聚合酶链反应法(nPCR)检测血清中HBV cccDNA
[目的]建立套式聚合酶链反应法(nPCR)检测慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA).[方法]根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计两套相对保守的引物,建立HBV cccDNA nPCR,并用该法检测96例慢性乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA.[结果]该法低检出量为5×102拷贝/ml,96例慢性乙型肝炎患者中,55例HBV cccDNA阳性,阳性率为57.3%.[结论]套式PCR方法简便,灵敏度高,可用于测定乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA,尤其是对HBV DNA水平低的患者.
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乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立及应用
[目的] 建立和应用半巢式聚合酶链反应法(PCR)检测慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA).[方法] 根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计3个相对保守的引物,建立HBV cccDNA半套式PCR,并用该法检测96例慢性乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA.[结果] 96 例慢性乙型肝炎患者中,35 例HBV cccDNA阳性,阳性率为36.5%.HBV cccDNA阳性组的HBeAg、HBV DNA、ALT和AST水平均明显高于阴性组(P＜0.05),但两组的HBsAg水平无显著差异(P>0.05).HBV DNA≥105组的HBV cccDNA检出率为58.3%(35/60),明显高于HBV DNA<105组(0%,0/36)(P=0.000);HBeAg阳性组的HBV cccDNA检出率为50.9%(28/55),明显高于HBeAg阴性组(7/41,17.1%)(P=0.001).[结论] 半套式PCR方法简便,可用于测定血清中HBV cccDNA,以评价抗病毒治疗慢性乙型肝炎的疗效.
