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丙肝病毒的免疫逃避和细胞免疫反应失败
Farei等在研究丙型肝病毒包膜基因序列的演化过程中发现其有快速的变化,并且发展为慢性丙肝者其基因序列校后清除病毒者有更多的变异.根据这些资料作者认为当急性丙肝感染时,丙肝病毒准种的变化动力学,预示该感染的结局是清除病毒或发展为慢性丙肝.
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HCV 5'-NCR基因变异与干扰素免疫应答关系的探讨
目的 了解HCV 1b基因型5'-NCR基因变异株的感染状态.方法 应用限制性内切醇酶切分析检测119例1b型中5'-NCR基因变异.结果 在119例HCV 1b型中存在5种感染状态:①有Mbo I切点变异株占58.0%(69/119);②元Mbo I切点变异株占16.0%(19/119);③有Mbo I切点和无Mbo I切点混合感染株占10.9%(13/119);④有BamH I切点变异株占10.1%(12/119);⑤有Mbo 1双切点变异株占5.0%(6/119).1例干扰素治疗有效的丙型肝炎患者,HCV RNA持续阴性,未检测出5'-NCR变异(有Mbo I单一切点),而2例干扰素治疗12个月和26个月的丙型肝炎患者血清ALT反复升高,HCV RNA持续阳性样品中,1例检出5'-NCR Mbo I酶切位点变异.结论 研究结果提示,在丙型肝炎患者血清中存在HCV 1b型中5'-NCR基因单一的Mbo I切点的样品,58.0%可能是HCV野生株感染的状态.
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丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定
目的: 构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒,并获得NS5B蛋白的高效表达,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件. 方法: 利用PCR技术扩增HCV ns5b基因,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上,转化大肠杆菌JM109菌株,获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b, 阳性质粒转化BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定,并以薄层扫描分析对其定量. 结果: 成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b,经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白25%,Western-Blot结果显示表达蛋白保持活性. 结论: HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达.
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RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用
目的: 研究RNAi(RNA interference)效应对HCV ns5b基因表达的抑制作用.方法: 根据HCV ns5b基因序列及其二级结构特征,依据Tuschl等设计siRNA的原则,确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs;利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B-EGFP HepG2细胞株,以未转染的细胞为对照; 细胞爬片后经DAPI染色,荧光显微镜下观察和半定量RT-PCR法检测siRNAs的抑制效应.结果: 化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达,效率可达70%-80%以上.结论: 在细胞水平上,化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达,为利用RNAi抑制HCV RNA复制的研究奠定基础.
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HBsAg/HCcAg融合表达细胞系的建立
目的建立融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的体外培养细胞系,使之作为细胞杀伤实验的靶细胞. 方法将含HBV S和HCV C融合基因真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法转染p815细胞,G418筛选后,再用有限稀释法进行单细胞克隆筛选. RT-PCR与免疫荧光法分别检测基因转录与蛋白表达. 结果 HBV S基因与HCV C基因的RT-PCR检测均为阳性, HBV表面抗原与HCV核心蛋白的免疫荧光检测均为阳性. 结论成功获得融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的细胞系.
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HCV C区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达
目的观察HCV C区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达情况. 方法构建pEF-HCV C重组质粒,转染SP2/0细胞,经G418进行筛选 ,建立稳定转染pEF-HCV C 的SP2/0细胞系. 并将转染后的SP2/0细胞接种于BALB/c小鼠皮下产生浆细胞瘤. 结果用斑点杂交方法检测转染后的细胞,有HCV mRNA. 免疫组化检测瞬时转染以及稳定转染的SP2/0细胞涂片均发现存在有阳性信号. 另外,对瘤组织进行免疫组化检测,发现有HCV C蛋白表达. 结论 pEF-HCV C重组质粒可以在SP2/0细胞中长期稳定表达,也可以在BALB/c小鼠浆细胞瘤内表达.
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慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析
目的:研究慢性HCV(丙型肝炎病毒)感染患者外周血单个核细胞(PBMC)体外Th1类细胞因子的分泌,进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制. 方法:体外培养慢性HCV感染患者PBMC 72 h后,ELISA检测培养上清Th1类细胞因子(IL-2,IFN-γ,TNF-α),荧光定量PCR检测患者血清HCV RNA含量,RT-PCR检测HCV RNA亚型. 结果:与正常人相比,IFN-γ在HCV RNA阴性患者中明显增高,而在RNA阳性患者中无明显升高. TNF-α则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高. RNA阳性患者ALT(丙氨酸氨基转移酶),AST(门冬氨酸氨基转移酶)水平明显高于阴性患者. 不同HCV基因型感染的患者IFN-γ,TNF-α的分泌无显著差异. 结论:IFN-γ在清除病毒中起重要作用,TNF-α是引起肝脏损伤的重要因素之一.
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三种抗-HCV检测试剂盒对无偿献血者筛检价值评价
目的:评价3种抗-HCV筛检试剂对无偿献血者的筛检价值. 方法: 以卫生部临床检验中心抗-HCV临床科研血清盘标本50 份为评价标本,分别用快速试剂法,国产ELISA试剂及进口ELISA试剂对评价标本作盲法检测,以卫生部临床检验中心血清盘标本所提供的阴性和阳性结果为金标准,用四格表法计算出评价真实性及可靠性指标,并对ELISA 法的cut-off值的合理性进行评价. 结果: 快速试剂法,国产英科新创ELISA试剂盒与进口傲拓ELISA试剂盒的灵敏度分别为48%, 88%, 76%,特异度均为100%,准确度分别为74%, 94%, 88%. 约登指数分别为0.48, 0.88, 0.76. 3种试剂盒的重复符合率均为100%. 国产英科新创ELISA试剂盒规定的cut-off值是合理的,而进口傲拓ELISA试剂盒规定的cut-off值太高. 结论: 3种试剂盒的灵敏度与准确度以国产ELISA试剂盒为好,3种试剂盒的重复性均好,因此使用2种优选的国产ELISA试剂盒对血液进行联合筛检,既可以保证输血的安全性,又可以减低筛检成本.
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西安和郑州地区丙型肝炎患者的HCV基因分型
目的了解西安和郑州地区丙型肝炎病毒(HCV)感染的基因型,比较两地基因型分布的差异. 方法采用限制性长度多态性分析(RFLP)法对采自西安地区的46份和郑州地区的40份HCVRNA阳性标本进行HCV基因型分型研究. 结果西安地区46份标本中,25份(54.3%)为1 b型病毒,17份(37.0%)为2 a型病毒,4份(8.7%)为1b/2a混合型病毒;郑州地区40份标本中,19份(47.5%)为1 b型,13份(32.5%)为2 a型,3份(7.5%)为1 a型,4份(10.0%)为1 b/2 a混合型病毒,1份(2.5%)为1a/1b混合型病毒. 结论两地的优势株均为HCV1b型,其次为2 a型,郑州地区有1 a型菌株的发现.
