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HCV C-Fc融合基因修饰的树突状细胞疫苗抗HCV功能研究
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)C-Fc基因修饰的树突状细胞(DCs)能否诱导抗HCV细胞和体液免疫反应.方法将pcDNA3HCV-Fc质粒用电穿孔法转染经过白介素4(IL-4),粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激增殖的小鼠DCs前体细胞,观察HCV、Fc抗原表达;将制备的5×105/100μlDC疫苗皮下免疫Balb/c小鼠,两周后检测特异性抗体、脾脏CD4+、CD8+细胞增殖作用以及诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果 HCV C-Fc基因电穿孔法转染细胞在上述细胞因子作用下发育成能有效表达HCV C-Fc并具有典型形态学与表型特征的DCs.免疫小鼠后,HCV C-Fc基因转染DCs能诱导产生抗HCV特异性抗体和较强的CTL反应.结论 HCV C-Fc基因修饰的DCs能增强对HCV特异性CTL效应的诱导能力,提示它在抗病毒疫苗发展中的潜力.
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丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响
目的研究丙型肝炎病毒核心区(HCV-C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响.方法首先运用基因重组技术构建含有HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+),然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞(HCV-C转染HepG2细胞),经逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV-C蛋白表达.然后进行如下实验:(1)利用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测HCV-C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率;经流式细胞术(FACS)检测3组细胞的细胞周期;(2)经流式细胞术检测细胞凋亡率;(3)经端粒重复扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)法检测上述3组细胞端粒酶活性表达情况.结果(1)HCV-C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率;HCV-C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率;(2)HCV-C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV-C转染细胞凋亡率;(3)上述3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性.结论(1)HCV-C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用;(2)HCV-C蛋白促进HepG2从G0/1期进入S期,从而可能促进细胞生长增殖,抑制细胞凋亡;(3)HCV-C蛋白对HepG2细胞端粒酶活性没有影响,说明HCV-C蛋白不是通过上调细胞端粒酶活性途径来调节细胞周期、促进细胞增殖和抑制细胞凋亡.
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丙型肝炎病毒高变区1融合蛋白的表达、纯化及其初步应用
目的克隆并表达中国不同地区不同基因型的丙型肝炎病毒高变区1(HCV HVR1)蛋白,并用表达纯化产物检测慢性丙型肝炎患者血清中的相应抗体,分析其临床意义.方法根据31株HCV HVR1序列分析及免疫原性预测结果,选择4株克隆(1b型3株,2a型1株),从pGEMT-E2克隆中扩增得到4个HVR1片段,将其分别克隆到原核表达载体pQE40中,表达产物经纯化后用以检测慢性丙型肝炎患者血清中的HVR1抗体.结果构建的HVR1原核表达载体在大肠埃希菌中成功表达了4种相对分子质量约为28 000的二氢叶酸还原酶(DHFR)-HVR1融合蛋白,纯化蛋白的获得率约为320～800 μg/100ml培养液.这4种融合蛋白(SH1b、BJ1b、SD1b、SD2a)与慢性丙型肝炎患者的血清结合率分别为72.8%(51/70)、60%(42/70)、48.6%(34/70)和58.6%(41/70).在20例用干扰素治疗的丙型肝炎患者中,57%(4/7)的干扰素治疗无应答者治疗前血清能与之反应,而应答者血清中只有15.3%(2/13)能与之反应.干扰素治疗应答者血清与4种融合蛋白反应的A值高于治疗无应答者(P＜0.05).结论选择的4株HCV HVR1片段在大肠埃希菌中获得成功表达,所得4种HVR1融合蛋白能与HCV感染者血清发生较广泛的反应.
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脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对HCV 5'-非编码区的抑制活性
目的观察特异性脱氧核酶(DRz)在丙型肝炎病毒(HCV)5'-非编码区(5'-NCR)转基因肝癌细胞株中对靶RNA的抑制活性.方法采用5'-GGCTAGCTACAACGA-3'基序为活性中心,分析HCV 5'-NCR中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征的位点及5'-NCR的二级结构以确定靶位,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz-232、DRz-127、DRz-84、DRz1以及对应的两端被硫代修饰的DRz(TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MDRz).用脂质体转染法将导入HCV 5'-NCR及部分C区(5'-NCR-C)的转基因肝癌细胞株HepG2.9706中,作用一定时间后,用化学发光法检测荧光素酶活性的变化,计算抑制率.选择抑制率较高者进行时效关系的观察和不同浓度抑制效果的比较.结果各DRz和对应TDRz的活性无明显差别.DRz-127/TDRz-127和DRz1/TDRz1的抑制活性相对较高,终浓度为0.5μmol/L作用24 h抑制率分别达53.2%/50.6%和44.7%/43.3%.各DRz/TDRz的抑制率均高于对应的MDRz,其中DRz-127/TDRz-127与MDRz-127(41.2%)相比抑制率有显著性差异,P＜0.05.在0.25～0.75 μmol/L范围,抑制率随药物浓度的升高而增高.在所观察的时间点中,加药后24 h抑制率高,3 d后抑制率显著下降;DRz抑制率的下降快于TDRz.结论靶位合适的HCV特异性脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对靶RNA可能既存在反义抑制作用,又存在剪切活性,可能是一种有希望的抗病毒基因治疗手段.经适当硫代修饰的TDRz在细胞内可能更稳定.
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丙型肝炎病毒特异性锤头样核酶体外转录及切割活性的初步研究
目的研究针对丙型肝炎病毒(HCV)特异性锤头样核酶(Rz)的体外转录及切割活性.方法设计3种锤头样核酶:Rz1、RZ2分别作用于HCV RNA 5'-非编码区(5'-NCR)上核酸序列136～160、313～337,Rz3作用于核心(C)区上核酸序列373～388.为区别于反义核酸的封闭作用,设计在RZ3的催化环上存在点变异(G取代A)的变异核酶Rzm用作对照.体外转录出靶HCV RNA和核酶RNA,在一定条件下,将32P标记的靶HCV RNA与核酶RNA按不同浓度比例进行切割反应,电泳后放射自显影,通过同位素扫描成像分析仪分析来评价核酶切割效率.结果除Rzm外,在生理温度下,3种核酶均有活性,并随核酶浓度增加而提高;核酶切割靶位点距HCV起始密码子近切割效率高.结论设计并观察到体外具有HCV特异性切割活性的锤头样核酶,为进行核酶的细胞内应用研究奠定基础.
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丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达
目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV NS3基因.方法用聚合酶链反应(PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCV NS3基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析.结果成功构建HCV NS3基因酵母表达载体,Western免疫印迹显示了HCV NS3在酵母细胞中表达.表达产物在胞内存在,相对分子质量为70 000.结论HCV NS3蛋白在酵母中表达成功.
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抑制性RNA对细胞内HCV IRES介导HCV核心蛋白表达抑制作用的定量分析
目的定量观察核糖体内部进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)对细胞内HCV IRES介导的HCV C基因表达的抑制作用.方法构建IRES特异性IRNA的真核表达载体(pcRz-IRNA),将该质粒与pcHCVcluc(含HCV 5′非编码区、核心区与荧光素酶基因)共转染人肝细胞癌(HHCC)细胞株,对转染后72 h细胞表达HCV C抗原进行间接免疫荧光染色,用激光共聚焦显微镜对其含量进行定量分析.用荧光素酶检测试剂盒对其活性进行检测.结果共转染细胞可表达HCV C抗原,同对照组相比,IRNA组荧光量明显下降.结论在IRNA与HCV共转染细胞中,IRNA对HCV IRES介导蛋白翻译具抑制作用.
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丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶在大肠埃希菌中的表达
目的表达具有野生起点的丙型肝炎病毒(HCV)RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)并研究其聚合活性,分析其是否具有逆转录酶活性.方法构建截短的具有野生起点的HCV RdRp表达质粒,观察不同诱导温度对表达产物可溶性的影响.以多聚腺苷为模板,分别观察在寡聚脱氧胸苷和寡聚尿苷引导下RNA的合成.以互补引物模板评价所表达的HCV RdRp的逆转录酶活性.结果在16℃诱导温度条件下获得截短具有野生起点的HCV RdRp的可溶性表达.在聚合反应体系中同时具有引物与模板时,获得RNA链的合成,多聚核苷为引物的聚合效率明显高于以多聚脱氧核苷为引物的聚合效率.在表达的HCV RdRp指导下,脱氧核苷掺入到互补引物模板体系中,随着反应时间的延长,10聚的互补引物/模板延伸为13聚的产物,但不能延长至14聚.结论获得可溶性的HCV RdRp表达,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性及有限的逆转录酶活性.其RNA依赖的RNA聚合酶活性有一定的引物依赖性.
关键词： C型肝炎样病毒属 依赖于DNA的RNA聚合酶 逆转录酶 -
丙型肝炎病毒体外感染肝癌细胞株HepG2的初步研究
目的研究人肝癌细胞株HepG2对丙型肝炎病毒(HCV)的易感性,建立细胞感染模型.方法将人肝癌细胞株HepG2与慢性丙型肝炎患者血清共同温育6～8 h,收集不同时相点标本,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测细胞内或上清液中正负链RNA,免疫组织化学法检测细胞内HCV NS3、NS5特异性抗原的表达情况,以及原位杂交法检测细胞内HCV负链RNA.结果接种感染血清3～35 d,可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA;HCV NS3、NS5特异性抗原能在感染细胞内稳定表达,阳性物质位于胞浆中;原位杂交法证实细胞内存在负链RNA,也位于胞浆中.结论人肝癌细胞株HepG2不但对HCV易感,而且可以稳定地支持HCV体外复制.
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丙型肝炎病毒1b型NS5A区基因复杂性与干扰素α疗效的关系
目的探讨丙型肝炎病毒1b型(HCV-1b)NS5A区基因的复杂性与干扰素α(IFN-α)治疗效果之间的关系.方法以13例接受IFN-α治疗的HCV-1b感染患者为研究对象,治疗前血清提取的RNA采用逆转录套式PCR (RT-nested-PCR)扩增HCV NS5A区基因,PCR产物纯化后与T载体连接并克隆入大肠杆菌,随机挑选30个阳性克隆菌落,每一克隆菌落再进行PCR扩增,30个克隆的PCR产物在同一聚丙烯酰胺凝胶上采用单链构象多态性分析(SSCP)分析和异源性双体分析(HD)筛选HCV NS5A区克隆型,克隆型的多少反映HCV NS5A区基因的复杂程度.结果完全应答组平均6.3种克隆型;部分应答组平均8.6种克隆型;无应答组平均15.8种克隆型.结论 HCV NS5A区基因的复杂程度与IFN-α的治疗效果呈负相关.
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丙型肝炎患者PBMC的mIL-2R表达及其临床意义
目的探讨丙型肝炎患者mIL-2R表达水平及其临床意义.方法用生物素-链酶亲和素法对56例抗-HCV阳性患者外周血单个核细胞(PBMC)进行植物血凝素(PHA)诱导前后mIL-2R的的检测.结果急、慢性丙型肝炎患者静息状态mIL-2R表达水平,诱导状态mIL-2R表达水平分别与正常对照相比,差异均有显著性.结论丙型肝炎患者体内存在明显的细胞免疫功能紊乱,T细胞活化障碍,并与肝病的慢性化有关.
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套式PCR法检测慢性丙肝患者PBMC及血清中HCV-RNA的意义
目的探讨慢性丙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)内HCV-RNA与血清中HCV-RNA的相互关系及其在慢性丙肝发病机制中的作用.方法用套式PCR(RT-nested-PCR)对124例抗-HCV(+)慢性丙肝患者的PBMC及血清中HCV-RNA进行检测.结果 124例抗-HCV(+)慢性丙肝患者中,PBMC及血清中HCV-RNA阳性率分别为53.23%(66/124)和64.52%(80/124),经χ2检验,两者差异无显著性(P>0.05).各慢肝组PBMC与血清HCV-RNA阳性率相比,差异均无显著性(P>0.05).结论 HCV可隐匿于患者PBMC中;PBMC中HCV-RNA与血清中HCV-RNA似有一致性倾向.PBMC中HCV-RNA检测不仅是对常规血清检测的重要补充,而且是HCV肝外感染的直接证据,是导致丙型病毒性肝炎患者易于慢性化的重要原因之一.
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丙型肝炎病毒感染与HCC相关性的研究
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝细胞癌发生的关系。方法用聚合酶链反应(PCR)对淮南地区92例肝癌、117例肝硬化和100例肝癌切除的肝组织标本进行HCV-RNA检测，并以限制性片段长度多态性分析对其中89例HCV-RNA阳性血清进行了HCV基因分型。结果肝癌组 HCV感染率29.3%，肝硬化组HCV感染率26.5%，肝组织标本组HCV感染率31.0%；各组均以HCV Ⅱ型为主(65.2%),HCV Ⅲ型次之(31.5%)。结论淮南地区肝癌的诱发与HCV感染密切相关，HCV Ⅱ型在本地区HCV相关性肝癌和肝硬化的发生中可能起主要作用。
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逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析
目的确定用于丙型肝炎病毒(HCV) RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清(浆)标本的佳收集和保存条件.方法 按设定的不同条件处理,用逆转录聚合酶链反应测定HCV RNA.结果用高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存 HCV RNA血清,其阳性检出率有差异(P<0.05).血凝固后4 h内离心分离血清对HCV RNA阳性检出率不造成明显改变(阳性率为85%);12 h后检测则变化明显(阳性率降至75%).采用枸橼酸钠和EDTA-K2抗凝剂的血浆管 HCV RNA检出率分别为90%和95%,显著高于血清管(为65%).反复冻融影响标本阳性检出率,标本在-20℃保存3个月或半年几乎不影响检测结果.结论收集和保存HCV RNA检测标本应尽量用EDTA抗凝管,在4 h内分离血浆;若用血清标本,好在4 h之内分离血清,标本长期保存应分装且存放在-70℃.
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原发性肝癌患者乙型及丙型肝炎病毒感染的检测
目的调查原发性肝癌患者乙型及丙型肝炎病毒感染情况. 方法采用免疫组织化学SP法检测157例原发性肝癌患者乙型肝炎病毒(HBV)及丙型肝炎病毒(HCV)感染情况,每例患者均有血清学检测资料,另取30例良性肝病组织作对照,所有数据用卡方检验. 结果 157例原发性肝癌患者中HBV感染阳性率为31.8%(50/157),HCV感染阳性率为51.0%(80/157),其中107例原发性肝细胞癌HBV、HCV感染阳性率分别为39.3%(42/107),45.8%(49/107),50例胆管细胞癌HBV、HCV感染阳性率分别为16.0%(8/50),62.0%(31/50),原发性肝细胞癌、胆管细胞癌HBV、HCV重叠感染率分别为27.1%(29/107),14.0%(7/50),良性肝病组HBV、HCV感染阳性率分别为16.7%(5/30),30.0%(9/30).原发性肝细胞癌HBV感染、胆管细胞癌HCV感染率高于良性肝病组,差异均有显著性(P<0.05).原发性肝细胞癌HBV、HCV血清学检测阳性率分别为87.8%(94/107),13.1%(14/107),胆管细胞癌HBV、HCV血清学检测阳性率分别为68.0%(34/50),16.0%(8/50). 结论原发性肝癌与HBV、HCV的感染有密切关系.
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丙肝病毒抗体化学发光酶免疫分析方法的建立和应用
[目的]建立丙肝病毒抗体化学发光酶免疫分析方法(CLIA)并应用于临床检测.[方法]以辣根过氧化物酶(HRP)为酶标记物,以鲁米诺为发光底物,采用双抗原夹心法检测血样中的抗丙肝病毒(HCV),建立抗HCV化学发光酶免疫分析方法;并与常规使用的抗HCV酶联免疫分析方法(ELISA)同时检测500例血浆标本中的抗HCV,以荧光定量PCR为金标准,探讨其临床应用价值.[结果]CLIA方法敏感度为0.2 ng/mL,变异系数<10%,稳定性好.CLIA和ELISA同时检测500例血浆标本,ELISA检测出7例阳性,CLIA检测出8例阳性,经PCR检测终确定结果与CLIA相符.[结论]CLIA法检测HCV敏感、准确、稳定性好,适合临床推广应用.
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维持性血液透析患者丙肝病毒感染预后分析
目的 探讨丙肝病毒感染对维持性血液透析患者预后的影响.方法 对106例死亡的维持性血液透析患者按丙肝阳性和丙肝阴性分组进行回顾性分析.结果 两组年龄、性别、原发病、肾功能、血糖、血脂、Hb、 Kt/V无统计学差异.阳性组出现肝酶升高、血白蛋白降低,较阴性组有显著性差异.阳性组透析龄59个月较阴性组85个月明显缩短,心血管事件为两组常见死亡原因.结论 丙肝病毒感染维持性血液透析患者肝功能异常,生存时间缩短.
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丙肝病毒相关冷球蛋白血症性肾炎
丙肝病毒感染可引起冷球蛋白血症以及肾小球肾炎,冷球蛋白血症相关膜增生性肾小球肾炎是HCV相关肾炎的主要类型,本文主要就近年HCV相关冷球蛋白血症性MPGN的发病机理以及治疗进展作一综述.
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丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达
目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段.方法利用PCR技术,扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段,双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a/HCVc.转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达.SDS-PAGE鉴定表达情况,Western blot鉴定表达产物的抗原性.结果经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达;SDS-PAGE电泳显示其在32 000处有一条融和表达条带;Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性.结论HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,而且表达产物有良好的抗原性.
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Gibbs抽样在HBV、HCV感染与肝癌关系的病例-对照研究meta分析中的应用
[目的]对中国人乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及其双重感染与原发性肝癌关系的病例-对照研究结果进行定量综合,探讨Gibbs抽样方法在meta分析中的应用价值.[方法]制订meta分析的文献纳入和剔除标准,经分析筛选,有16个研究纳入.在WinBUGS上由二项分布建模,拟合3个Logistic模型,通过Gibbs抽样得到3组(HBV感染、HCV感染及双重感染)参数的后验分布.[结果] HBV感染的效应合并值μ10为2.86(合并优势比OR为18.05,95%可信区间CI为10.71～28.80),HCV感染的效应合并值μ01为2.49(合并OR为13.11,95%CI为5.28～27.02),双重感染的效应合并值μ11为4.49(合并OR为93.54,95%CI为49.44～167.30).[结论] meta分析结果表明,HBV、HCV感染均为中国人原发性肝癌发生的主要病原学因素.双重感染大大增加发生原发性肝癌的危险性.Gibbs抽样能灵活地构造模型对复杂问题进行meta分析,特别是当经典方法不适用时.
