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柴胡提取物对大鼠海马原代培养神经元5-HT3受体介导离子通道的影响
目的:探讨柴胡提取物(Radix BupleuriExtract,RBE)含药血清对抑郁情绪模型大鼠原代培养的海马神经元5-羟色胺3受体(5-HT3R)通道电流的作用.方法:复制抑郁情绪大鼠模型,以柴胡提取物进行药物干预,采用旷场实验和糖水偏好实验评价模型,制备各组大鼠血清并灭活除菌,对原代培养的大鼠海马神经元干预24 h后,采用全细胞膜片钳技术检测各组神经元5-HT3R通道电流.结果:与正常组相比,模型组大鼠旷场实验总分显著性降低(P＜0.01),糖水偏好系数显著降低(P＜0.01),模型组大鼠血清孵育的海马神经元电流密度值明显增加(P＜0.01);与模型组相比,柴胡提取物组和氟西汀组旷场实验总得分明显提高(P＜0.05,P＜0.01),糖水偏好系数均明显增加(P＜0.05,P＜0.05),柴胡提取物和氟西汀含药血清孵育的海马神经元电流密度值均明显减少(P＜0.01,P＜0.01).结论:柴胡提取物能改善抑郁情绪模型大鼠异常的5-HT3R通道电流,这可能是其发挥抗抑郁情绪的中枢机制之一.
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17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮对心肌细胞内游离钙浓度及L-型钙电流的影响
目的:研究17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮(YLSC)对H2O2诱导的心肌细胞内钙超载的拮抗作用及对L型钙电流(ICa-L)的影响.方法:采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,实验分为①正常对照组；②H2O2组:上机前加入终浓度为0.3 mmol·L-1的H2O2;③预先给予低、中、高不同终浓度YLSC药物处理组:分别给予100,200,400 μmol·L-1YLSC的无血清培养基,孵育24 h,上机前加入终浓度为0.3 mmol· L-1H202,以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入H202后15 min内检测细胞内[Ca2+]i的变化；分离昆明种小鼠单个心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对ICa-L的影响.结果:①与正常对照组比较,H202诱导的模型组细胞内[Ca2+]i增加60.43％±7.75％,而高、中、低YLSC预处理组[Ca2+]i分别增加38.39％±13.87％,14.49％±2.94％,-28.1％ ±1.52％,与模型组比较显著降低(P＜0.01).②YLSC可使心室肌细胞ICa-L的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)关系曲线上移,能改变ICa-L的激活和失活特征,使ICa-L的激活曲线和稳态失活曲线左移.结论:YLSC对心肌细胞钙离子通道有较好的阻断作用,能显著减轻H2O2诱导的心肌细胞内[Ca2+]；超载.
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益气复脉合剂抗乌头碱致大鼠心肌细胞动作电位异常的研究
目的:利用膜片钳技术阐述益气复脉合剂抗心律失常的作用机制.方法:采用酶解法分离大鼠心肌细胞,利用膜片钳方法考察益气复脉合剂抗乌头碱致大鼠心肌细胞动作电位异常的作用.结果:益气复脉合剂可显著缩短乌头碱所致动作电位时程APD、APD50、APD90的延长,对静息电位、超射、幅度及大上升速率并无明显改变.结论:益气复脉合剂抗乌头碱致室性心律失常的作用机制可能与抑制心室肌细胞的Ca2+内流以及K+外流有关.
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培养大鼠海马胆囊收缩素阳性神经元的电生理学特性
目的 探索海马内胆囊收缩素(CCK)阳性(CCK+)神经元的电生理学特性.方法 用整合有CCK启动子-绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒对培养海马CCK+神经元进行标记,应用全细胞膜片钳技术对标记CCK+神经元的电生理学特性进行研究.结果 CCK+神经元的胞体长径为(22.85±0.77) μm,短径为(16.21±0.42) μm(n=20),静息电位(RMP)为(-55.90±1.30)mV,膜电容(Cm)为(45.77±2.06) pF,膜阻抗(Rm)为(711.00±46.69) MΩ; CCK+神经元500 ms内100 pA去极化电流诱发动作电位的发生频率为(26.17±3.41) Hz (n=12);CCK+神经元的自发抑制性突触后电流的发生频率[(5.26-±0.71)Hz,n=7]显著高于自发兴奋性突触后电流的发生频率[(3.24 ±0.62)Hz,n=6].结论 CCK+神经元的相关电生理学特征可能与其在中枢神经系统内重要的调节功能相关.
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血管紧张素Ⅱ及卡托普利对犬心房肌细胞外向钾通道电流的作用
目的 观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及卡托普利对犬心房肌细胞外向钾通道电流的作用,揭示其参与房性心律失常的细胞电生理机制.方法 健康成年杂种犬(普通级)10只,体质量(15-20)k,雌椎不拘,天津利群实验动物服务中心提供.急性分离单个犬心房肌细胞,采用伞细胞膜片钳方法 分别记录Ang Ⅱ及卡托普利灌流前后细胞膜快速延迟整流钾电流(Ikr)、缓慢延迟整流钾电流(Ikr)、超快速延迟整流钾电流(Ikr)及短暂外向钾电流(It0).采用pClamp 7.0 for windows及pClampfit7.0软件测量电流;数据用均数±标准差((-x)±s)表爪;应用SPSS 10.0统计软件进行统汁学分析,用药前后的比较采用自身配财t枪验,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 0.5t mol/L Ang Ⅱ可增加,Ikr、Iks,抑制Ito[(19.54±2.41)pA/pF VS.(24.83±2.52)pA/pF,P=0.001;(20.69 4±2.29)pA/pF vs.(25.59±3.42)pA/pF,P=0.0003;(6.34±1.93)pA/pF vs.(3.71±1.50)pAZpF,P=0.001)],对Ikur无明显影响[(19.78±1.22)pA/pF vs.(20.39±1.50)pA/pF,P=0.258];5 mol/L卡托普利对,¨Iks Ikur 及均无明显作用[(19.11±4.91)pA/pF vs.(18.99±4.04)pA/pF,P=O.808;(20.76±2.89)pA/pF vs.(20.27±3.46)pA/pF,P=0.305;(18.50±3.78)pA/pF VS.(18.25±4.02)pA/pF,P=0.704;(7.31±1.99)pA/pF vs.(6.89±2.12)pA/pF,P=0.136)].结论 Ang II通过对外向钾电流的影响促进心房颤动时的心房屯重构,卡托普利作为血管紧张素转换酶抑制剂,可能通过抑制肾素.血管紧张素系统呆改善心房颤动时的心房电重构,对心房颤动有防治作用.
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缬沙坦对豚鼠心室肌细胞离子通道电流的影响
目的 观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对缬沙坦对豚鼠心室肌细胞离子通道电流的影响.方法 采用全细胞膜片钳技术的电压钳方法记录心室肌细胞的离子通道电流,包括L-Ca2+电流(L-ICa);延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(Ik1).结果 缬沙坦100μmol/L组的心室肌细胞IK峰值电流,为7.15±0.78(pA/pF),明显低于对照组(6.42±0.85(pA/pF),(P＜0.01)呈电压依赖性.缬沙坦100 μmol/L不影响心室肌细胞Ik1及L-ICa电流.结论 高浓度缬沙坦抑制心室肌细胞延迟外向钾电流,而不影响内向整流钾电流及内向L-ICa.提示缬沙坦抑制延迟外向钾电流,适度延长动作电位时程,从而延长心室有效不应期,有助于折返引起的快速室性心律失常的防治.类似Ⅲ类抗心律失常的作用.
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咪达唑仑对神经病理性痛大鼠DRG神经元GABA-AR激活电流的增强作用
目的:观察大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury CCI)致神经病理性痛后,咪达唑仑对背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元上γ-氨基丁酸A受体(gamma-aminobutyric acidA receptor,GABA-AR)激活电流的调控作用.方法:运用全细胞膜片钳技术,记录假手术、CCI组、正常组GABA-AR激活电流的变化、以及咪达唑仑对坐骨神经慢性压迫性损伤后GABA-AR激活电流的影响.结果:CCI组GABA(0.1～1000μmol/L)激活的电流幅值显著小于假手术组和正常组.假手术组和正常组由GABA (0.1～1000μmol/L)激活的电流幅值差异无统计学意义.不同浓度咪达唑仑(0.03～100 μmol/L)对CCI组GABA-AR激活电流均有增强作用,且随咪达唑仑浓度升高,对DRG神经元GABA-AR激活电流的增强率逐渐升高,3.00 μmol/L咪达唑仑时达峰值(P＜0.05或0.01).结论:在CCI组中,DRG神经元GABA-AR功能的改变导致的突触前抑制作用的减弱可能是疼痛产生的关键因素之一.咪达唑仑对CCI组GABA-AR功能有增强作用,增强GABA-AR参与突触前抑制作用,可能是其在脊髓水平产生镇痛的机制之一.
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坐骨神经压迫性损伤大鼠背根神经节NaN/SNS2钠通道表达的变化
目的:观察电压门控钠通道NaN/SNS2在大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constrictioninjupy,CCI)14天后的变化,探讨慢性神经痛的发生机制.方法:以逆转录多聚酶链反应(RTPCR)半定量分析CCI后大鼠背根神经节(Dorsal root gamglion,DRG)钠通道NaN/SNS2转录物的变化,以及全细胞膜片钳技术记录CCI对急性分离大鼠背根神经节TTX-R钠电流的影响.结果:CCI术后14天,感觉神经元特异性的TIX-R钠通道转录物NaN/SNS2下调,与对照组相比,下降了大约30%,TTX-R钠电流密度明显减弱,但不影响其激活与稳态失活.其激活曲线的V1/2分别为-26.6378mV、-26.6306mV,k为6.7864mV、6.7323mV;失活曲线的V1/2分别为-35.5844mV、-37.2188mV,k为8.2792 mV、8.4647mV.结论:钠通道NaN/SNS2与慢性神经痛后初级感觉神经元过度兴奋有关.
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腰5脊神经结扎大鼠腰4背根神经节神经元超极化激活电流的变化
目的:研究腰5脊神经结扎(L5 spinal nerve ligation,SNL)神经病理痛大鼠腰4背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元超极化激活电流(Ih)及其通道超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)发生的可塑性变化.方法:以单侧L5 SNL制备神经病理痛大鼠模型,运用全细胞膜片钳技术记录和分析背根神经节神经元Ih的表达和激活特性.结果:L5 SNL之后,腰4 DRG神经元Ih的电流密度降低,单位电导下降,而翻转电位及电压依赖特性未发生显著性改变.结论:腰4DRG神经元Ih的这些变化可能贡献于L5 SNL大鼠的神经病理痛.
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去甲肾上腺素对慢性压迫背根节神经元的兴奋作用
目的:观察去甲肾上腺素对大鼠正常及慢性压迫背根节中具有后去极化的神经元的兴奋性作用.方法:急性离散大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元后,以全细胞膜片钳技术记录了正常DRG神经元及慢性压迫DRG神经元的膜电位及放电数目在施加去甲肾上腺素(NE)前后的改变.结果:在NE的作用下,受损DRG内具有后去极化(afterdepolarize potential,ADP)的30个神经元中有13.3%出现自发放电,20%出现兴奋性增强;而检测的正常DRG内具有ADP的20个神经元在NE的作用下未出现自发放电,也无兴奋性增强.结论:受损DRG的ADP神经元对NE的反应显著增强,ADP可能参与交感神经维持痛的形成.
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大鼠受损背根节中型感觉神经元的温度敏感性
目的:观察大鼠损伤背根节(DRG)中型感觉神经元的热温度敏感性.方法:在急性离散的大鼠DRG中型神经元上,运用全细胞膜片钳技术,观察不同温度梯度刺激下受损DRG神经元的放电的特征.结果:大鼠损伤DRG中型神经元与热温度变化有一定的关系,它们根据放电模式可分为3型,其中62%(26/42)的中型神经元与热温度变化密切相关,随着温度的升高而引发的逐渐增强的膜电位去极化可引发频率由低到高的动作电位.随着温度的降低神经元又表现出频率由高到低的动作电位变化,放电后有规律的膜电位振荡,于较弱的超极化刺激可产生反跳动作电位,动作电位的幅值不一致.该类神经元具有电压依赖性.结论:大鼠受损DRG中型感觉神经元特别是紧张型放电的神经元对非伤害性刺激反应强烈,具有热温度敏感性.
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前列腺酸性磷酸酶可能通过突触前机制参与骨癌痛大鼠脊髓镇痛
目的:运用神经电生理学方法,观察前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)对骨癌痛(cancer-induced bone pain,CIBP)大鼠脊髓背角神经元兴奋性的影响.方法:SD雌性大鼠12只,随机分为两组(n=6):CIBP模型组和假手术组,CIBP组于右侧胫骨骨髓腔内接种5μl大鼠乳腺癌细胞(2×105个),14天后造模完成.运用腰髓薄片全细胞膜片钳记录两组大鼠脊髓背角神经元兴奋性的变化,在灌流液中加入PAP,观察PAP对两组大鼠脊髓背角神经元兴奋性的影响.结果:脊髓薄片全细胞电压钳研究表明,与假手术组大鼠对比,骨癌痛大鼠脊髓背角Ⅱ层神经元自发的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory post-synaptic currents,sEPSCs)和刺激电极诱发的兴奋性突触后电流(evoked excitatory post-synaptic currents,eEPSCs)的幅度显著增大,而sEPSCs的频率未见变化.给予PAP灌流,PAP显著降低骨癌痛大鼠脊髓背角Ⅱ层神经元的sEPSCs发放频率,而对其幅度未见明显影响;且该效应可被腺苷A1R的拮抗剂CPX翻转.PAP对于假手术组大鼠脊髓背角神经元兴奋性没有明显影响.结论:PAP可能通过突触前机制参与骨癌痛模型大鼠的脊髓镇痛过程.
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膜片钳技术在慢性痛大鼠背根神经节神经元电生理学特性改变中的应用
目的：以骨癌痛大鼠为例，探讨全细胞膜片钳技术在慢性痛研究中的应用。方法：急性分离背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元，利用全细胞膜片钳技术分别记录对照组和骨癌痛组大鼠小直径DRG神经元的动作电位及TRPV1（transient receptor potential vanilloid channel subfamily V member 1）的电流，分析大鼠小直径DRG神经元电活动的变化。结果：利用全细胞膜片钳技术可以记录到骨癌痛大鼠的小直径DRG神经元静息膜电位绝对值降低、动作电位发放频率增加、爆发动作电位的阈值降低、TRPV1通道的电流幅度增大。结论：全细胞膜片钳技术可以有效而直观的记录到单个神经元动作电位和电流的变化，并由此对神经元电生理学特性进行分析，从而进行慢性痛发病机制的研究。
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氟比洛芬酯对表达心脏SCN5A基因HEK293细胞钠电流的影响
目的:利用人胚肾293(HEK293)细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并观察氟比洛芬酯(flurbiprofen axetil,FA)对钠通道的影响.方法:野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于HEK293细胞,应用全细胞膜片钳记录使用FA(0.15 μM)前后的钠电流.结果:转染效率约为70％,和使用FA前相比,用药后在每一指令电压上钠电流都减小;在测试电压为-40mV的条件下,钠电流峰值电流密度从(-159.74±63.80)pA/pF降至(-94.48±62.63)pA/pF(n=7,P=0.012);通道稳态激活半激活电压(V1/2)分别为(-51.66±7.69)mV和(-58.19±2.45)mV(n =7,P=0.048);稳态失活半激活电压(V1/2)分别为(-83.55±3.21)mV和(-85.25±4.78)mV(n =7,P=0.041);通道失活后恢复τ分别为(33.86±23.18) ms和(67.71±58.58)ms(n=7,P=0.048).结论:FA可以减小各测试电压下的钠电流峰值(电压电流曲线向上漂移);加速通道的电压依赖性激活,促进通道的电压依赖性失活,失活后恢复变慢.
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Ⅲ度房室传导阻滞与钠通道SCN5A基因相关分子遗传学机制研究
目的：探讨国人Ⅲ度房室传导阻滞患者与心脏钠离子通道编码基因SCN5A基因的相关性。
方法：收集我院Ⅲ度房室传导阻滞患者临床资料，并抽取外周血提取全基因组DNA。使用DNA直接测序法筛查SCN5A基因的外显子及外显子和内含子的交界区。如发现基因变异，通过对200位同种族的健康人群相对照，以鉴别基因变异类型。使用定点突变法对SCN5A质粒进行定点诱导突变，构建SCN5A-A1428S、SCN5A-S593G突变质粒，并通过DNA测序法验证突变成功后转染至人胚肾HEK293细胞。应用全细胞膜片钳技术检测野生型及突变型HEK293细胞的钠电流相关参数进行分析，探讨基因型及表型的关系。 -
Ano1在心脏成纤维细胞中的功能表达及其意义
目的 探讨钙激活氯通道蛋白anoctamin 1(ANO1)在小鼠心脏成纤维功能表达及其意义.方法 利用胶原酶急性分离心房成纤维细胞;应用RT-PCR检测到成纤维细胞ANO1 mRNA的表达;利用western blot检测到ANO1蛋白在小鼠心肌成纤维细胞中表达;利用膜片钳技术记录钙激活氯电流,结果 成纤维细胞表达ANO1 mRNA和蛋白,有钙激活氯电流,该氯电流可以被特异性的阻断剂CaCCinh抑制.结论 ANO1在小鼠心脏成纤维细胞中有明确表达,ANO1是钙激活氯通道的分子基础.
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5-羟色胺对人胎盘滋养细胞钙通道的影响
目的 探讨5-羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响.方法 将体外培养的胎盘滋养细胞分成3组,低深度5-羟色胺组(5-TH,1 μmol/L)、高浓度5-TH组(10μmol/L)和对照组.采用全细胞膜片钳方法,在胎盘滋养细胞外液中分别加入L-型钙通道阻滞剂、T-型钙通道阻滞剂、钠通道阻滞剂及5-TH,检测其电流值.结果 在-60～-50 mV电压时,胎盘滋养细胞L-型钙通道开放,-40～-30 mV时,其大峰值电流为(82.31±6.46)皮安(pA).加入尼莫地平(Nimodpine)可阻断大部分电流.氟桂利嗪(Flunarizne)和替曲朵辛(TTX)不能抑制该电流成分.加入 1μmol/L和10μmol/L 5-TH,其峰值电流分别为(104.77±10.84)pA和(117.16±9.67)pA,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine 、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine 后,峰值电流分别为(85.35±6.54)pA和(89.42±7.62)pA,与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 5-TH可激活胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加.
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羟苯氨酮激活家兔血管平滑肌细胞钙敏感钾通道
目的研究羟苯氨酮(oxyphenamone,Oxy)扩张血管作用机理.方法用全细胞膜片钳技术,监测家兔肠系膜阻力血管平滑肌细胞钙敏感钾通道电流变化以及Oxy对其的影响.结果 0.1 μmol·L-1 Oxy明显增加钙敏感钾通道电流,冲洗后恢复至给药前水平;0.01～10 μmol·L-1 Oxy明显增加钙敏感钾通道电流,且呈现浓度依赖性.结论 Oxy呈浓度依赖性和可逆性的增大血管平滑肌细胞钙敏感钾通道电流.
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丹参注射液对背根神经节细胞超极化激活电流通道的影响
目的 观察丹参对背根神经节细胞超极化激活通道电流的影响,探讨丹参缓解疼痛和阻滞钙内流,以及减轻钙超载的作用机制.方法 应用全细胞膜片钳技术,观察了丹参注射液对大鼠背根神经节细胞超极化激活电流(Ih)通道的影响.结果 10%,25%和50%的丹参注射液对大鼠背根神经节细胞Ih通道的电流幅值、激活时间常数和翻转电位均没有影响,但可使Ih通道电流的半激活电压向超极化方向偏移.结论 丹参特异性地使Ih通道电流的半激活电压向超极化方向偏移所产生的对外周痛敏的对抗作用,可能也是其缓解疼痛的作用机制之一.
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发展基于活细胞的FlexStation3高通量钙荧光方法及筛选TRPV3通道抑制剂
为了建立高通量筛选TRPV3通道调节剂的方法,本研究利用FlexStation3酶标仪,针对瞬时转染TRPV3通道的HEK293T细胞的密度、Cal-520染料的浓度及染料孵育时间进行了条件优化.结果显示,40 000个细胞/孔、5.0％的Cal-520染料浓度及1.5 h的染料孵育时间为佳实验条件.应用该筛选方法,筛选并发现来源于睡莲科植物的有效成分甲基莲心碱(neferine)能够抑制TRPV3通道,该抑制作用经全细胞膜片钳实验证实并测得其IC50为24.5±4.1 μM(n=6).对其它TRPV通道成员的选择性电生理学评价结果显示,甲基莲心碱对TRPVl和TRPV4通道无抑制作用.总之,实验数据显示,FlexStation3高通量钙荧光筛选可以用于发现TRPV3以及其他TRP通道的调节剂,筛选发现的天然产物甲基莲心碱可以作为TRPV3通道的工具药研究通道的药理学功能.
关键词： TRPV3通道抑制剂 甲基莲心碱 FlexStation3 全细胞膜片钳 钙离子
