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慢病毒介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质修复股骨大段缺损
背景:课题组前期研究已证实,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2 基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势.但慢病毒介导人骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质能否在体内促进骨缺损修复的问题有待探究.目的:观察兔股骨大段缺损中植入慢病毒介导人骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质后的修复效果,探寻治疗股骨大段缺损的新途径.方法:选取48只新西兰大白兔,股骨中段截骨钢板内固定法制备兔左侧股骨大段缺损模型.造模成功后,随机分成A,B,C,D组,每组12只.A 组无修复材料植入,B,C,D组分别植入脱钙骨基质、脱钙骨基质/骨髓间充质干细胞、慢病毒载体介导人骨形态发生蛋白2/骨髓间充质干细胞/脱钙骨基质.造模后2,4,8 及12 周分别处死每组3只兔子,通过苏木精-伊红染色、生物力学分析,X射线检查评价股骨大段缺损修复的情况.结果与结论: ①X 射线示A,B,C,D组均有不同的骨痂修复形成,且Lane-Sandhu X射线评分A
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可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥的制备与细胞相容性
背景：应用预制成形的材料修复不规则骨缺损时，常出现材料与骨缺损形状不匹配的问题，制备可任意塑形骨泥对促进不规则骨缺损的愈合具有重要意义。
目的：构建可塑形脱钙骨基质/透明质酸骨泥，筛选佳复合比例并评价其细胞相容性。
方法：选取合格供体皮质骨制备脱钙骨基质。分别配置浓度为0.75%，1.5%，3%，4.5%的透明质酸溶液并检测其黏度，以450 mg脱钙骨基质与上述各浓度透明质酸溶液1 mL混合，制备不同比例的脱钙骨基质/透明质酸骨泥。37℃条件下将骨泥浸泡在PBS平衡液中，观察其离散时间，筛选佳复合比例的脱钙骨基质/透明质酸骨泥。应用脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液培养L-929小鼠成纤维细胞，1，4，7 d采用CCK-8法检测骨泥的细胞毒性。
结果与结论：随透明质酸浓度的增加其溶液黏度增大，脱钙骨基质/透明质酸骨泥的离散时间延长，3%浓度的透明质酸与450 mg脱钙骨基质复合制备的骨泥具有良好可塑形能力，离散时间为8 h，为佳复合比例。脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液培养L-929小鼠成纤维细胞1，4，7 d的细胞增殖率分别为93.72%，101.65%，97.68%，细胞毒性级别为0或1级。表明脱钙骨基质/透明质酸复合质量比为15∶1制备的骨泥具有良好的可塑形能力及抗离散能力，细胞毒性轻微。 -
脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏
背景:前期研究应用玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周,得到玻璃化冻存液合适的配比成分.延长玻璃化冻存时间至12周,是否仍能保持细胞活力以及成骨能力值得进一步研究.目的:探讨短时(1周)、长时(12周)玻璃化冻存对组织工程骨中脂肪干细胞增殖活性和成骨能力的影响.方法:分离新西兰大白兔脂肪干细胞,扩增至第3代,接种于猪松质骨来源的脱钙骨,成骨诱导1周.将构建的组织工程骨,转移至含有玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜,70%LG-DMEM,0.8 mol/L海藻糖)的2 mL冻存管中,将冻存管投入液氮冻存.分别于冻存后1周和12周,复苏1,3,7,11,13 d,用活死双染试剂染色,共聚焦显微镜观察脂肪干细胞在脱钙骨上的生长情况.复苏1,3,5,7,9,11,13 d,用Hochest33258法检测支架材料上的细胞数目.复苏1,4,7,10,14,21 d,用PNP微板法检测碱性磷酸酶活力,Real-time PCR检测成骨基因Runx2,OCN,COL-1,ALP的表达.结果与结论:①细胞活死双染结果显示,冻存1周或12周后,复苏1 d时红染的死细胞较冻存前红染的死细胞多,复苏3 d后绿染的活细胞逐渐增多;②Hochest33258结果表明,与冻存前的细胞数相比,冻存1周或者12周后,复苏第1,3天的细胞数目有所降低,复苏3 d后细胞数目开始持续增加,复苏第5天细胞数目恢复至冻存前水平;③复苏后1,4 d,碱性磷酸酶活力降低但是与冻存前比较差异无显著性意义,复苏4 d后碱性磷酸酶活力持续升高;④复苏后1,4 d,成骨基因Runx2,Col-1,ALP,OCN表达降低但是与冻存前相比差异无显著性意义,复苏4 d后成骨基因表达持续升高;⑤玻璃化冻存1周与12周比较,复苏后的细胞活力和成骨活性差异均无显著性意义;⑥实验初步证实,玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活力与成骨活性;冻存时间(1,12周)对复苏后组织工程骨的成骨能力没有显著影响.
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天然可降解脱钙骨基质材料复合脂肪干细胞的三维培养
背景:脱钙骨基质是一种常用的组织工程支架材料,脂肪干细胞是近年来发现的一种成体干细胞,二者均可自体取材,二者复合培养的研究还未见报道.目的:观察脂肪干细胞与脱钙骨基质复合后三维培养的生长、增殖情况.方法:无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫,采用I型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞,系列传代传至第3代,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达.切取兔髂骨,制备脱钙骨基质.取第3代脂肪干细胞,与脱钙骨基质复合后共培养,1周后扫描电镜观察细胞黏附和生长情况,2周后石蜡包埋切片进行苏木精-伊红染色.结果与结论:自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速,第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达,CD34为阴性;制备的脱钙骨基质为三维立体多孔结构,具有良好的可塑性,并有一定的机械强度.复合培养后电镜扫描、苏木精-伊红染色显示,细胞在脱钙骨基质表面和孔隙内黏附生长良好,并能继续增殖和分泌胞外基质.结果提示脂肪干细胞与脱钙骨基质复合共培养生长增殖良好,并能分泌细胞外基质.
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完全脱钙松质骨的生物学特性
背景:脱钙松质骨被认为是一种"理想"的软骨组织工程支架材料已被广泛应用,但对其某些生物学特征目前仍不是十分清楚.目的:体外观察脱钙骨基质的降解性能、孔隙率以及骨髓间充质干细胞和脱钙骨基质的黏附性.设计、时间及地点:体外观察实验,分别于2005-01-08/04-15在兰州大学骨科研究所和2007-08-01/11-15在桂林医学院中心实验室进行.材料:取青紫兰兔四肢骨干骺端及椎体松质骨,采用Urist提供的方法制作脱钙骨基质.方法:将脱钙骨基质置于磷酸盐缓冲溶液中测定其降解率;用液体置换法测其孔隙率;用细胞计量法测定生长良好的浓度为1×10~8L~(-1)的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的黏附率.主要观察指标:脱钙骨基质的降解率、孔隙率及骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的黏附率.结果:脱钙骨基质的降解随时间的延长逐渐加速,完全降解需要10-12周;所测孔隙率为(77.15+3.44)%:浓度为1×10~8L~(-1)的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质具有较高的黏附率(平均为71.25%).结论:脱钙骨基质的降解曲线和骨髓间充质干细胞的增殖曲线相一致,具备良好的孔隙率和黏附率,提示脱钙骨基质可能为软骨组织工程比较理想的生物支架材料.
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同种异体脱钙骨基质研究现状
同种异体骨为替代自体骨移植的首选材料.经脱脂、脱水、脱钙、冻干等处理制备的脱钙骨基质,具有较低的免疫源性,又保留骨形态发生蛋白等一些骨生长因子而具有骨诱导活性,已广泛运用于骨科临床.本文对同种异体脱钙骨基质的成骨能力,及其构成复合材料、组织工程材料的研究方面进行综述.
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骨形态发生蛋白-4的研究进展
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成员,是1965年由Urist等首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种具有独特异位骨和软骨诱导活性的酸性蛋白质.
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异体脱钙骨基质粉复合自体骨髓构建可注射人工骨的实验研究
目的:探讨异体脱钙骨基质粉(DBM)复合自体骨髓(AM)构建可注射人工骨替代材料的可行性,检验其异位诱导成骨能力.方法:将24只新西兰兔随机分为3组,分别在背部皮下注射DBM/AM、DBM、AM,术后2,4周取材,通过大体观察、X线、组织学检查、扫描电镜研究以及碱性磷酸酶(ALP)测定,进行比较观察.结果:DBM与AM按照一定比例复合后可以通过注射途径应用,X线、组织学检查结果均表明DBM/AM组有较多新骨形成,新生骨具有丰富的哈氏系统结构,骨基质内胶原纤维的结构排列交错紊乱,新生骨边缘可见大量的成骨细胞突起;DBM组仅见微量软骨和骨新生,AM组诱导出少量新生骨.DBM/AM组ALP水平较DBM组、AM组高,统计学上具有显著性差异(P＜0.01).结论:DBM/AM复合可注射人工骨具有良好的骨诱导性和应用价值.
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犬脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞的体外培养
目的:制备犬脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM),研究DBM作为骨组织工程支架材料的可行性.方法:杂种犬的股骨行脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白、冷冻干燥、灭菌制成DBM,与骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)复合,应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察脱钙骨基质的结构及细胞在材料表面的生长情况.结果:犬脱钙骨基质具有三维立体网孔结构,平均孔隙直径为(254.39+88.71)μm,孔隙率约为70%.与MSCs复合培养后,细胞黏附其上,上架率高,生长状态良好,增殖迅速,并分泌大量细胞外基质.结论:DBM具有良好的生物相容性.
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脱细胞脱钙人牙用于大鼠颅盖骨缺损修复的实验研究
目的:探讨脱细胞脱钙牙作为骨支架材料的可行性和诱导大鼠颅盖骨缺损成骨能力.方法:离体人牙24颗,分别进行脱钙和脱钙脱细胞处理.实验1-取6只10～12周龄雄性SD大鼠,在大鼠腹部皮下同时包埋脱钙牙、脱细胞脱钙牙,4周后处死大鼠,进行H-E染色,观察2种材料周围炎症反应情况.实验2-取12只10～12周龄雄性SD大鼠,制备双侧颅盖骨区域骨缺损,在左侧骨缺损处植入脱细胞脱钙牙,以未植入任何材料的右侧作为空白对照,4周、8周时分别处死6只,获取完整标本,进行Micro-CT扫描,从大体形态学上比较成骨量.取4周大鼠进行H-E染色,观察周围炎症反应,免疫组织化学观察新生成骨程度.采用SPSS 23.0软件包进行重复测量方差分析.结果:实验1-4周时H-E染色显示,脱细胞脱钙牙与周围组织炎症反应程度显著小于脱钙牙.实验2-取4周和8周的大鼠颅盖骨进行Micro-CT扫描和骨缺损处新生骨量定量分析,显示植入脱细胞脱钙牙的骨缺损处成骨量显著多于空白对照组量(P＜0.05).4周时H-E染色结果显示,脱细胞脱钙牙周围的炎症反应程度与空白对照处相似.免疫组织化学染色显示,脱细胞脱钙牙周围新生的成骨细胞显著多于空白对照组.结论:脱细胞脱钙人牙是一种具有良好生物相容性、成骨诱导能力和可塑性的生物支架材料.
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骨形成蛋白作盖髓剂的探讨
早在1965年,Urist[l]报道脱钙骨基质可诱导异位骨内外组织的间充质细胞分化形成新骨.此后,Urist等在这方面做了大量的研究,并已分离出了一种具有这种骨诱导活性的蛋白--骨形成蛋白,又称骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Pro-tein,BMP).目前已在兔、鼠、牛、猴等动物及人的骨基质中、牙本质基质中和小鼠及人的骨肉瘤中发现了这种蛋白成分.目前已发现了15种BMP,除BMP-1外,其余都属于转化生长因子(TGF-β)超家族的成员.研究发现,BMP是通过与细胞表面受体结合发生作用的,其I型和Ⅱ型受体是跨膜的丝氨酸或苏氨酸激酶,它与膜上配体结合形成受体复合体从而传递信号.现已标记出7种不同的工型丝氨酸或苏氨酸受体,称为苯丙酸诺龙受体样激酶ALK1-6.另外,亦已分离出BMPⅡ型受体[2].
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脱钙骨基质的骨修复功能及其在口腔临床医学中的应用前景
脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)是同种异体或异种骨经过脱钙、脱脂、去蛋白处理得到的产物,主要成分包括胶原和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs),具有良好的生物相容性和满意的三维空间结构,并且能够诱导未分化的间充质细胞分化为成骨和成软骨细胞,在骨、软骨缺损修复中具有重要作用.目前,应用DBM进行骨缺损的修复治疗显示了良好的临床效果,本文针对DBM在骨缺损修复中的作用机制及其在口腔颌面部的应用做一综述,并展望DBM在牙体牙髓修复中的应用.
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人股骨头制作的脱钙骨基质和脱蛋白骨成骨诱导活性比较
目的 比较人无菌性坏死股骨头制作的脱钙骨基质(DBM)和脱蛋白骨(DPB)的体外成骨诱导活性.方法将人股骨头制作成的DBM和DPB与人骨髓间充质于细胞(hBMSCs)复合培养,并以单层细胞为对照组.检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)和钙离子(Ca2+)的浓度.结果 两种材料均表现出成骨诱导活性,DBM材料组的ALP、OC和Ca2+浓度均明显高于DPB组和对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 DBM和DPB均具有成骨诱导活性,且DBM的成骨诱导活性更强.
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脱钙骨基质复合牛骨形态发生蛋白修复兔桡骨缺损实验的放射学评价
目的:对异体脱钙骨基质复合BMP修复节段性骨缺损能力进行放射学评价.方法:64只新西兰大白兔采用桡骨15 mm节段性骨缺损模型,随机分为4组,A组植入异体脱钙骨基质(Demineralized BoneMatrix,DBM)与牛骨形态发生蛋白(Bovine Bone Morphogentic Protein,bBMP)复合材料,B组植入异体DBM,C组植入异体骨粒,D组为空白对照组.术后4 w、8 w、12 w、16 w,进行放射学检查和相应的组织学检查.结果异体DBM与bBMP复合材料组X线和组织学检查显示骨愈合修复情况要明显优于异体DBM组、异体骨粒组和空白对照组.结论:DBM经bBMP复合后,可提高修复骨缺损的能力,是一种较为理想、具有高效成骨活性的植骨材料.
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异体脱钙骨基质复合bBMP修复兔桡骨骨缺损
目的:探讨异体脱钙骨基质复合BMP修复节段性骨缺损的能力.方法:64只新西兰大白兔采用桡骨15 mm节段性骨缺损模型,随机分为4组,A组植入异体脱钙骨基质(Demineralized Bone Matrix,DBM)与牛骨形态发生蛋白(Bovine Bone Morphogentic Protein,bBMP)复合材料,B组植入异体DBM,C组植入异体骨粒,D组为空白对照组.术后4、8、12、16 w,进行放射学检查、病理组织学检查和计算机图像分析新生骨面积.结果:异体DBM与bBMP复合材料组骨生成、新骨面积和骨连接情况明显优于异体DBM组、异体骨粒组和空白对照组.结论:异体DBM复合BMP材料通过骨诱导和骨传导两种方式修复骨缺损,是一种较为理想、具有高效成骨活性的植骨材料.
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经椎弓根DBM植骨治疗胸腰椎爆裂性骨折
目的 探讨经椎弓根DBM(脱钙骨基质)植骨结合后路短节段椎弓根螺钉固定治疗胸腰椎爆裂性骨折可行性及临床疗效.方法 经椎弓根植入DBM人工骨结合后路短节段椎弓根螺钉固定(TPG+SSPI)治疗胸腰椎爆裂性骨折57例,其中男39例,女18例;年龄20～60岁,平均42.6岁;致伤原因:车祸伤17例,坠落伤33例,其它伤7例;损伤节段:胸12(T<,12>)23例,腰1(L<,1>)25例,腰2(L<,2>)9例.骨折按Denis分型:A型15例,B型36例,C型6例;所有患者术前及术后均行X线及CT检杏,记录所有患者手术前、后及末次随访的伤椎的高度,X线片测量Cobb角、VAS评分和Greenough腰痛评分.结果 57例患者平均手术时间115分钟;平均出血330mL.所有患者获随访,平均随访13个月.VAS疼痛评分由术前(5.1±4.2)分降至末次随访(2.1±0.3)分;Greenough评分由术前(12.8±9.1)分升至末次随访(59.6±10.5)分;临床疗效按照Greenough腰痛评分法评价,优良37例、好5例、一般13例、差2例,优良率为96.5%.结论 经椎弓根植入DBM人工骨结合后路短节段椎弓根螺钉固定治疗稳定型椎体爆裂性骨折,椎体高度及后凸角度无明显丢失,未出现迟发性神经损伤以及内植物松动、断裂等失效现象,近期疗效满意.
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不同接种方法构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体的对比研究
目的 在以脱矿脱细胞骨基质环为支架以纤维环细胞为种子细胞构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体过程中,探索佳的构建复合体方法.方法 分别使用纤维蛋白凝胶接种技术和传统的直接接种技术一静置法构建技术构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体.对构建产物进行倒置显微镜观察、扫描电镜观察和细胞计数,比较两方法的效果.结果 纤维蛋白凝胶接种技术构建的细胞支架复合体.细胞粘附更多、增殖更迅速.结论 纤维蛋白凝胶接种技术在以脱矿脱细胞骨基质环为支架以纤维环细胞为种子细胞构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体过程中,比静置法效果更好.
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应用脱钙骨基质和硫酸钙颗粒治疗骨缺损的初期结果
目的 探讨使用骨移植替代物脱钙骨基质(DBM)和硫酸钙颗粒(OSTEOSET)治疗骨缺损的疗效.方法 对同期手术治疗的52例骨缺损患者的缺损处,分别于术后第1、4、8周及3、6、12个月进行随访并摄X线片直至骨缺损愈合.统计分析患者的临床资料、X线片辅助分析骨缺损修复程度和并发症.结果 随访8～12个月,植骨术后6、12个月分别有95%和99%患者的骨缺损显示有明显的新骨形成,修复水平为60%～100%.并发症为3例(5.77%),经换药后治愈,未发生骨缺损不愈合.结论 DBM和OSTEOSET在骨愈合早期可加速骨缺损的修复,并可作为新鲜自体髂骨的替代物.
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同种异体螺纹骨笼结合脱钙骨基质治疗成人股骨头缺血性坏死
目的：探讨采用同种异体螺纹骨笼结合脱钙骨基质(DBM)治疗早、中期股骨头缺血性坏死(ONFH)的中期随访效果。方法采用同种异体骨支撑架结合 DBM 治疗40例(60髋)ONFH 患者并随访观察。按 Ficat分期：Ⅱ期35髋,Ⅲ期25髋。结果40例(60髋)获随访,时间9年6个月~12年5个月。术后 Harris 评分为(82．78±10．77),与术前(53．20±15．72)分比较差异有统计学意义(P <0．01)。其中优29髋,良20髋,可3髋,差8髋,优良率81．7%。差评的8髋全部行人工全髋关节置换术。结论同种异体螺纹骨笼联合 DBM治疗成人 ONFH 手术损伤小,特别是适合治疗早期 ONFH 的年轻患者,中期疗效满意,能有效防止股骨头塌陷。
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脱钙骨基质复合牛骨形态发生蛋白与单纯脱钙骨基质修复兔桡骨缺损比较
目的比较脱钙骨基质(DBM)复合牛骨形态发生蛋白(bBMP)和单纯DBM修复节段性骨缺损的能力.方法32只新西兰大白兔采用桡骨15 mm节段性骨缺损模型,随机分为2组:A组植入异体DBM与bBMP(10 mg)复合材料;B组植入异体DBM.术后4、8、12、16周,进行放射学检查、病理组织学检查和计算机图象分析新生骨面积.结果X线和组织学检查显示异体DBM与bBMP复合材料组的新骨生成、修复骨缺损能力优于异体DBM组,组织切片的计算机图象分析提示DBM+bBMP组修复新骨面积大于DBM组,两者之间差异有显著性(4、8、12周P＜0.05,16周P＜0.01).结论异体DBM复合bBMP材料通过骨诱导和骨传导两种方式修复骨缺损,其修复骨缺损的能力要优于单纯DBM材料,是一种较为理想,具有高效成骨活性的植骨材料.
