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金华市福寿螺感染广州管圆线虫的调查
[目的]了解金华市福寿螺分布和福寿螺感染管圆线虫幼虫情况.[方法]随机抽取相关县市进行野外、农贸市场和相关人员调查,采集螺样检测.[结果]在金东区2个村、兰溪市和东阳市各1个村的野外环境发现福寿螺,感染率分别为5%、6%、2%和8%,说明福寿螺感染管圆线虫幼虫的感染率较低.14个农贸市场未发现福寿螺销售;调查30名村民均不食用福寿螺.[结论]金华市部分野外有福寿螺孳生,但范围局限;市场未发现福寿螺销售;群众防病意识较强,近期发生广州管圆线虫病的可能较小.
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福建省广州管圆线虫病自然疫源地调查
目的 调查广州管圆线虫病自然疫源地在福建省的分布状况.方法 按不同方位与片区,对全省的41个县(市、区)的105个调查点进行广州管圆线虫中间宿主、转续宿主和保虫宿主种类与分布调查.结果 共检查样本25 595份,广州管圆线虫总感染率13.0％(3 319/25 595),其中中间宿主阳性率13.8％(2 742/19 823);转续宿主阳性率7.1％(36/506);终宿主阳性率10.3％(541/5 266).广州管圆线虫的感染宿主共24种,感染率高为沼水蛙(34.5％),其它依次为褐云玛瑙螺(33.5％)、高突足襞蛞蝓(28.8％)、光滑颈蛞蝓(23.1％)和福寿螺(19.4％)等;瘤拟黑螺、树蛙和泽蛙为福建省首次报告感染广州管圆线虫的新宿主.结论 广州管圆线虫病的自然疫源地遍布福建全省各地,传播宿主种类众多,且中间宿主大多数都被感染.广州管圆线虫病是今后福建省重点防控的人兽共患寄生虫病之一.
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福建省漳浦等4县广州管圆线虫中间宿主感染率调查
目的 探讨漳州市辖区漳浦等4县广州管圆线虫中间宿主感染情况.方法 在漳浦等4县8个调查点采集中间宿主,用肺检法、匀浆法检查其体内广州管圆线虫幼虫.结果 共调查12种贝类1 844份样本,有11种检出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,感染率12.6％(217/1 723);感染率前3位是高突足襞蛞蝓38.9％(61/157)、褐云玛瑙螺28.3％(86/304)和福寿螺19.7％(34/173),其他种类感染率1.2％～6.8％;不同种类宿主感染率差异较大;4县感染率较接近,漳浦12.9％ (58/451)、诏安14.0％(58/415)、平和11.6％(52/448)、长泰12.0％(49/409);靠近居民住宅点的感染率为20.2％(171/845),村外调查点为5.2％(46/878),村外点感染率较低.结论 广州管圆线虫对中间宿主的选择性不强,中间宿主种类多,但不同孳生环境和不同宿主感染率有明显差异.
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鲶鱼作为广州管圆线虫转续宿主的实验观察
目的 确定鲶鱼是否为广州管圆线虫中间宿主.方法 收集人工感染福寿螺所获广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,对鲶鱼进行人工定性与定量感染实验,将感染后所获的广州管圆线虫Ⅲ期幼虫感染大鼠,进行活力与回收率分析.结果 定性实验除投喂大鼠粪便外,投喂螺肉和肌肉注射均检到Ⅲ期幼虫；定量感染实验低浓度感染有利于幼虫的回收；Ⅲ期幼虫感染大鼠亦获得发育成熟的成虫,但所得Ⅲ期幼虫活力强、寿命短；.结论 鲶鱼可作为广州管圆线虫的转续宿主,鲶鱼是人们喜食的淡水鱼,但烹调不当易感染广州管圆线虫病.
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广州管圆线虫实验室模型建立的研究
目的 建立实验室条件下广州管圆线虫生活史模型,研究人工感染方法,为防控提供依据.方法 从疫区采集福寿螺,肺检法检查3期幼虫并计数,经口感染大鼠；6周后采集镜检鼠粪,确认大白鼠排虫期后,直接用该大白鼠粪便喂养阴性福寿螺,3周后解剖螺镜检3期幼虫并计数,经口感染大白鼠,感染量130条/只、40条/只、20条/只,各组5只,于大白鼠死亡或22周后解剖观察感染情况.结果 15只大白鼠均被感染,感染2周死亡大白鼠镜检可见脑部4期幼虫,5周后鼠粪可见1期幼虫,6周后所有感染鼠粪均检测到Ⅰ期幼虫；鼠粪感染福寿螺3周100％感染.结论 利用大白鼠与福寿螺为宿主在实验室条件下建立广州管圆线虫生活史.
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大白鼠感染广州管圆线虫后血清抗体的检测
[目的]通过广州管圆线虫感染大白鼠的血清抗体检测,为人体感染本虫的免疫诊断提供参考.[方法]用常规酶联免疫吸附试验(ELISA).[结果]大白鼠感染广州管圆线虫后20～233 d雄虫抗原的阳性率为90.5%(105/116);雌虫为98.3%(114/116).而感染后5～16 d的大白鼠仅为37.0%(27/73)和37.9%(21/58).[结论]大白鼠感染广州管圆线虫20 d后,应用ELISA检测其血清抗体具有较高的诊断价值.
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福建省龙海市广州管圆线虫贝类宿主种群生态及感染率调查研究
目的：调查龙海市医学贝类种群及其广州管圆线虫感染率。方法按不同类型孳生地设调查点，采集水生和陆生贝类。用肺检法检查大瓶螺肺囊，其他贝类用捣碎匀浆法，检查广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。比较匀浆法和肺检法在褐云玛瑙螺体组织的检查效果。调查影响贝类感染率的生态环境因素。结果调查9个乡镇27个调查点1673份标本，查出大瓶螺、石环棱螺、铜锈环棱螺、瘤拟黑螺、褐云玛瑙螺、高突足襞蛞蝓、双线嗜粘液蛞蝓和同型巴蜗牛等8种贝类，广州管圆线虫总感染率为19．78％。其中高突足襞蛞蝓高，达56．63％（47/83），褐云玛瑙螺和大瓶螺分别为39．32％（92/234）与27．14％（130/234）。各调查点感染率高低与其距离居民生活区远近密切相关。首次在瘤拟黑螺内检及广州管圆线虫幼虫。肺检法和匀浆法的检出率分别为87．1％与100．0％，两者差异有统计学意义。结论高突足襞蛞蝓、褐云玛瑙螺和大瓶螺为当地感染广州管圆线虫优势种群，感染率同各种贝类的微生态环境关系密切。瘤拟黑螺充当广州管圆线虫新宿主。肺检法不适合用于褐云玛瑙螺的的广州管圆线虫感染定性筛查。
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广州管圆线虫在长爪沙鼠体内的发育及其引起的病理损害
目的 观察广州管圆线虫在长爪沙鼠体内的发育及其引起的病理损害.方法 以广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫经腹腔注射感染成年长爪沙鼠(10条幼虫/鼠),感染后不同时间检查脑、心肺组织内的虫体,肉眼观察和病理切片检查脑、肺组织,于感染后第46 d采用直接涂片法检查粪便.结果 从感染的长爪沙鼠脑和心肺组织共检获虫体127条(♀62/♂65),平均虫数为(3.63±1.46)/鼠,感染后第23～30 d,检获虫体数多;虫体在感染后30 d内主要分布在脑,30 d后主要分布在肺;幸存的长爪沙鼠大多数广州管圆线虫能在其肺中发育至成虫并产卵,同时在部分沙鼠粪便中检查到Ⅰ期幼虫;病理结果显示蛛网膜下腔可见虫体,肺内有虫卵,广州管圆线虫从脑移行至肺导致嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎和肉芽肿性肺炎.结论 广州管圆线虫可在长爪沙鼠体内发育成熟并造成脑和肺组织的损害.
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广州管圆线虫感染小鼠脾脏T淋巴细胞亚群和细胞因子的变化
目的 观察小鼠感染广州管圆线虫后脾脏T淋巴细胞亚群及其细胞因子分泌水平的变化.方法 用从感染褐云玛瑙螺分离的广州管圆线虫第3期幼虫感染BALB/c小鼠,感染后第19d及第25d分批处死小鼠,分离脾细胞,使用细胞内细胞因子荧光染色方法,用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞中的T细胞亚群的含量,用双抗夹心ELISA法检测脾细胞培养上清细胞因子的浓度.结果 与对照组比较,感染小鼠脾脏CD4+、CD4+IL4+T淋巴细胞比例显著上升,而CD4+IL-17+、CD4+ IFN-r+T淋巴细胞比例显著下降;脾细胞培养上清细胞因子IL-4水平明显升高,而IL-17水平明显下降.同时,感染程度和感染时间等因素也可造成脾脏T淋巴细胞亚群及其细胞因子分泌水平的变化.结论 小鼠感染广州管圆线虫后,表现以脾脏CD4+T淋巴细胞大量增殖和Th2型淋巴细胞极化为特点.
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广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立和优化
目的 优化双向凝胶电泳的条件,建立适合广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的适二维电泳模型.方法 经研磨、反复冻融提取广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白质,测定其浓度后分别用pH3～10和pH4～7的固相胶条进行双向凝胶电泳,同时对双向电泳的条件进行调节和优化,银染后进行凝胶图像比较.结果 采用pH3～10的胶条分离蛋白时,蛋白质点分布较集中,各蛋白点间间距较小;pH4～7的胶条分辨率较高,蛋白分布均一,获得719个蛋白点,各蛋白点间距相对较大,避免了高丰度掩盖低丰度蛋白点,在相同的pH范围内,检测到的蛋白点更多,灵敏度更高.结论 建立和优化适合广州管圆线虫的二维电泳模型,其重复性好、分辨率高,为广州管圆线虫的蛋白质组学研究奠定了基础.
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中国南方不同品系福寿螺对广州管圆线虫易感性的研究
目的 本实验室前期的研究根据福寿螺外壳及软组织特点将其分为3类:黑色福寿螺、黄色福寿螺、灰色福寿螺.本实验通过对三类福寿螺对广州管圆线虫易感性进行研究,期望为广州管圆线虫病的防治提供证据.分别使用低剂量(1000条L1/只)和高剂量(4000条L1/只)的广州管圆线虫感染三类福寿螺以观察其易感性,结果发现高剂量感染组中,黄色福寿螺感染率低于灰色福寿螺(P＜0.05).黄色福寿螺对广州管圆线虫的易感性相对较低,这可能是黄色福寿螺在中国多个省份占优势的一个原因.
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广州管圆线虫感染小鼠血清细胞因子及IgG亚类的动态观察
目的 观察小鼠感染广州管圆线虫后机体免疫的动态变化.方法 分别采集感染前、感染后第1、3、7、18d的小鼠血清,用ELISA方法 检测血清中细胞因子IL-2、IL-4以及特异性免疫球蛋白G(IgG)亚类水平.结果 广州管圆线虫感染的小鼠血清中IL-2的水平较感染前呈逐渐下降趋势,IL-4的水平与感染前小鼠相比先下降后呈升高趋势.抗体IgG,的水平与感染前小鼠相比明显升高,IgG2a的水平与感染前小鼠相比未见明显变化.结论 小鼠Th1型免疫应答较弱,Th2型免疫应答增强.表明小鼠感染广州管圆线虫后机体细胞免疫较弱,体液免疫较强.
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广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达
目的 对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析.方法 以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的 基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中, 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达, Ni-IDA亲和层析纯化表达产物.免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性.结果 广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13 398.26Da.重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别. 结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达.
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不同水温下不同时间对福寿螺体内广州管圆线虫的杀灭作用
目的 观察不同水温下不同作用时间福寿螺体内广州管圆线虫死亡率的变化规律,为福寿螺的加工提供参考.方法 将感染广州管圆线虫的福寿螺随机分为4组,记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组.Ⅰ组5只,作为阴性对照;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组再分别分为4小组,分别为Ⅱ30、Ⅱ60、Ⅱ90、Ⅱ120,Ⅲ30、Ⅲ60、Ⅲ90、Ⅲ120,Ⅳ10、Ⅳ30、Ⅳ45、Ⅳ60,每小组5只.Ⅱ、Ⅲ组各小组分别在80±1℃、90±1℃的水中煮30s、60s、90s、120s,Ⅳ组各小组分别在100±1℃沸水中煮10s、30s、45s、60s.将所有螺壳消化后,观察福寿螺体内广州管圆线虫的死亡情况.结果 80℃、90℃、100℃时福寿螺体内广州管圆线虫死亡率达100%的短时间分别为90s、90s、45s.运用Spearman等级相关,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组作用时间与加权平均死亡率(WM)呈显著正相关(P＜0.01).运用3次模型分析Ⅱ、Ⅲ组作用时间与WM的曲线方程分别为Y=0.274+ 0.016x+ 2.01E-007x3(R=1,P＜0.05);Y=0 .274+ 0.016x -9.46E-005x2+1.30E-007x3(R=1,P＜0.05).显微镜下观察高温作用后的广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫(L3)结构破坏严重.结论 温度相同时,L3死亡率与时间呈正相关;作用时间过短,80℃、90℃＜1min,100℃＜30s,不能将L3全部杀死.
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广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆表达及免疫保护作用研究
目的 对广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因进行克隆、原核表达,并对表达产物的免疫保护作用作出初步鉴定.方法 将广州管圆线虫cystatin基因克隆入载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达.用纯化融合蛋白隔周免疫小鼠1次,共3次,设GST免疫及未免疫对照组,末次免疫后1w用广州管圆线虫Ⅲ期幼虫攻击感染,3w后剖杀小鼠,计算减虫率及保护率,并测定小鼠特异性IgG抗体水平变化.结果 成功构建了pGEX-4T-1/cystatin重组表达质粒,并在大肠杆菌中得以高效可溶性表达,融合蛋白免疫小鼠后诱导产生了58.1%的减虫率及20%的保护率,与对照组相比减虫效果显著(P<0.01).结论 广州管圆线虫cystatin基因能在大肠杆菌中高效表达并可诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫力.
关键词： 广州管圆线虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 分子克隆 免疫保护 -
BALB/c小鼠感染广州管圆线虫后脑内的动态变化
目的 观察广州管圆线虫感染BALB/c小鼠后其虫数在小鼠脑内的动态变化,探讨其感染后对人体可能的致病机制.方法 以广州管圆线虫Ⅲ期幼虫感染实验BALB/c小鼠,按感染的不同时间分批处死,镜下及肉眼观察脑内虫体数量及分布情况.结果 在BALB/c小鼠大、小脑内,广州管圆线虫的分布符合寄生虫感染宿主后先增后减的一般基本变化规律,虫体寄生的部位因感染虫体而受损.引起症状的时间变化与虫体在脑内变化规律基本相符.结论 小鼠感染广州管圆线虫以后,出现共济失调,抽搐等症状的时间与虫体在小鼠脑内的变化规律基本相符.为临床研究该病的相关临床症状及治疗提供了一定的实验依据.
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阿苯达唑和地塞米松对广州管圆线虫病疗效的动物试验
目的 观察阿苯达唑和地塞米松治疗广州管圆线虫病的效果,探讨药物的作用机制.方法 :以Balb/c 小鼠为动物模型,在感染后不同时间,用不同剂量的阿苯达唑治疗,并设立地塞米松进行联合治疗对照组.小鼠于感染后第22d解剖,计数脑组织中存活虫体,以减虫数统计药物疗效;同时观察脑组织切片病理变化;应用透射电镜观察阿苯达唑对虫体超微结构的影响,对药物的作用机制进行探讨.结果 阿苯达唑为治疗广州管圆线虫病的有效药物,感染早期用药效果显著.杀虫药和地塞米松的合用可有效减轻脑部炎症反应.阿苯达唑主要通过虫体体壁及肠道吸收而发挥作用.结论 阿苯达唑和地塞米松的联合应用可以有效治疗广州管圆线虫病.
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PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的建立与应用
目的 建立灵敏度高和特异性强的PCR方法检测广州管圆线虫几种中间宿主的感染.方法 根据广州管圆线虫大亚基rRNA基因的序列特点,设计合成特异性引物,建立广州管圆线虫PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行验证.结果 经琼脂糖凝胶电泳和DNA序列测定证实,建立的PCR检测方法具有极高的灵敏度和较好的特异性.结论 初步建立的PCR检测方法可用于中间宿主--螺类携带广州管圆线虫的检测和野外疫情监测,具有良好的推广价值.
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水温对广州管圆线虫感染福寿螺影响的研究
目的 通过观察不同水温对广州管圆线虫感染福寿螺的影响,了解福寿螺受感染的适宜水温和低临界温度.方法实验室培养子代福寿螺和福建株广州管圆线虫Ⅰ期幼虫分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、和30℃的恒温箱中预温4h,达到所需温度后,分别将各温度组广州管圆线虫Ⅰ期幼虫倒入相应温度组的螺容器内使其感染,24h后观察记录各组螺的开厣率并移置(24℃±1℃)水温环境中饲养.20d后进行解剖,统计各组螺的感染率及感染度,分析感染率和感染度与感染水温的相关性.结果 6组温度螺的感染率依次为0%、20%、55%、95%、100%、100% ,福寿螺的感染率与水温间变化趋势的曲线方程为Y= 1E-05x4 - 0.0011x3 + 0.0292x2 -0.2362x + 0.5833,推算低临界感染温度值为6.66℃.感染度与水温有相关性(rs=0.3448,P<0.0032).其中25℃与30℃虫负荷较高,25℃感染温度大于500条幼虫的螺数多.结论广州管圆线虫感染福寿螺的适宜水温范围为20～30℃,佳感染温度为25～30℃,理论上水温< 6.66℃,福寿螺丧失摄入幼虫的能力.根据温度范围及幼虫生长规律推断:春夏秋季为螺感染的危险温度;夏秋季为流行该病的危险季节.
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广州管圆线虫中间纤维蛋白的体外表达和初步免疫学鉴定
目的 对广州管圆线虫中间纤维蛋白(intermediate filament,IF)基因进行体外表达、纯化、鉴定和抗原性质分析.方法 将IF基因的重组表达载体pET-IF在大肠杆菌中表达,表达产物经组氨酸亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量,质谱分析氨基酸序列,生物信息学分析蛋白质结构,Western blot鉴定与人、大鼠和小鼠感染血清及人IgG4亚类的抗原反应性.结果 SDS-PAGE、质谱分析和Western blot证明本研究获得的纯化蛋白为预期蛋白IF,其分子量为47.8 kDa,肽指纹图谱与秀丽杆线虫IF蛋白家族具有高度同源性,并具有典型的IF结构特征,且IF结构的尾部存在抗原决定簇,融合蛋白IF能与大鼠感染血清、小鼠感染血清和患者血清IgG结合,也能与患者IgG4亚类结合.结论 体外获得了抗原IF纯化蛋白,研究显示其可用于人类外周血检测并有助于检测现症感染和疗效考核.
