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人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞SM22α蛋白的影响
目的:观察人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞及其骨架蛋白相关蛋白平滑肌22α(SM22α)的影响.方法:以人主动脉平滑肌细胞作为研究对象,复制性衰老9代细胞作为衰老模型,实验分为青年组(5代细胞),模型组(9代细胞),人参三七川芎提取物低、中、高(100,200,400 mg·L-1)剂量组及白藜芦醇组(10μmol·L-1),药物干预时间为48 h.采用β-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染细胞比率,流式细胞技术分析细胞周期,免疫荧光染色观察细胞SM22α形态的改变,实时荧光定量-聚合酶链式反应(qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测SM22α的mRNA及蛋白表达情况.结果:与青年组比较,模型组细胞体积增大,形态不规则,G0/G1期数量增多,S期数量减少,且β-半乳糖苷酶染色蓝染数量减少(P＜0.01),符合衰老模型特点,且SM22α染色模糊暗淡,边缘不显,荧光强度明显减弱,SM22α mRNA及蛋白表达均下降(P＜0.01).与模型组比较,药物干预后,可以有效的增加β-半乳糖苷酶染色蓝染细胞数量,减少G0/G1期的细胞数量,同时增加S期的细胞数量,增强SM22α荧光染色强度,使得SM22α mRNA及蛋白表达均增加,并具有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01).结论:复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型;骨架蛋白相关蛋白SM22α的形态、基因表达和蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显,其可能与骨架蛋白一同参与了平滑肌细胞衰老的进程;人参三七川芎提取物一定程度上延缓了血管平滑肌细胞的老化,且对于SM22α有明显干预作用,并可能通过此作用及对骨架蛋白的作用一同延缓血管老化的进程.
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人参三七川芎提取物对衰老大鼠免疫器官及行为学的影响
目的:观察人参三七川芎提取物对老龄大鼠免疫器官功能及行为学的影响.方法:选取100只SD大鼠,饲养至18～19月龄,建立自然衰老大鼠模型.按体重水平分层后将成模大鼠随机分为5组,分别为衰老模型组、人参三七川芎中药低、中、高剂量组(2 305.64,1 152.82,576.41 mg·kg-1)和白藜芦醇组(50 mg·kg-1),另设2月龄SD大鼠做为青年对照组.干预3个月后,进行旷场实验,记录大鼠跨越方格总数和总行径距离,检测大鼠血清活性氧族(reactive oxygen species,ROS)含量,胸腺系数和脾脏系数.结果:与青年组大鼠比较,自然衰老组大鼠跨格总数减少(P＜0.01),总行径距离减少(P＜0.05),血清ROS含量增高(P＜0.01),胸腺系数和脾脏指数下降(均P＜0.01).与衰老模型组比较,中药各组和白藜芦醇组大鼠的跨格次数和总行径距离均有增加(P＜0.05);血清活性氧族(ROS)含量降低(P＜0.05);中药高剂量组和白藜芦醇组可以增高大鼠的胸腺系数和脾脏系数(均P＜0.01),中药中剂量组可以增高大鼠的胸腺系数(P＜0.05).结论:人参三七川芎提取物可以改善自然衰老大鼠精神迟缓状态,增强其空间探索性,同时能够提高免疫器官功能和降低血清活性氧含量.
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人参三七川芎提取物抑制p53基因表达促进衰老内皮细胞增殖的研究
目的:探讨益气活血中药对血管内皮细胞衰老和p53基因表达的干预作用.方法:分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC),传代培养至第4代,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,10-6mol/L,48h)诱导其衰老;分为空白对照组、AngⅡ组、中药提取物组和替米沙坦组;观察各组不同时间点β-半乳糖苷酶染色、CCK-8细胞计数、细胞周期分析、p53 mRNA及蛋白表达.结果:AngⅡ组较空白对照组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数增加(P＜0.05);CCK-8检测活细胞数减少(P＜0.05);细胞大量停滞于G0/G1期,而S期和G2/M期逐渐消失(P＜0.05).中药提取物组和替米沙坦组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数下降(P＜0.05),CCK-8活细胞数增加(P＜0.05),细胞周期阻滞改善(P＜0.05).中药早期作用更加明显(P＜0.05).AngⅡ呈时间依赖性上调p53 mRNA和蛋白表达;中药提取物和替米沙坦两组p53表达均明显下调(P＜0.05);中药早期作用更加明显(P＜0.05).结论:益气活血中药能够有效地延缓血管内皮细胞衰老,其机制可能与抑制p53基因表达有关.
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人参三七川芎提取物激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ延缓血管内皮细胞衰老的研究
目的:探讨血管内皮细胞衰老过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)的表达变化和益气活血中药人参三七川芎提取物的干预作用.方法:分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC),传代培养至第4代,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,10-6mol/L,48h)诱导其衰老;分为空白对照组、AngⅡ组、中药提取物组和替米沙坦(telmisartan)组;观察不同时间点β-半乳糖苷酶染色、NO含量、PPARγ mRNA及蛋白表达.结果:AngⅡ组较空白对照组p-半乳糖苷酶阳性染色细胞数增加(P＜0.05),NO含量明显下降(P＜0.05).与AngⅡ组比较,中药提取物组和替米沙坦组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数下降(P＜0.05),NO含量增加(P＜0.05).AngⅡ呈时间依赖性上调PPAR γ mRNA表达,但蛋白表达呈现早升后降趋势;中药提取物和替米沙坦两组PPAR γ表达均明显上调(P＜0.05),中药早期作用更为显著(P＜0.05).结论:益气活血中药能够延缓血管内皮细胞衰老,其机制可能与诱导PPAR γ表达有关.
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人参三七川芎提取物对高糖高脂诱导的衰老血管内皮细胞自噬的影响
目的 观察人参三七川芎提取物对血管内皮细胞自噬流的影响,探讨其延缓高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的作用机制.方法 采用40 mmol/L葡萄糖和100μmol/L棕榈酸钠造模,实验分为空白对照组、衰老模型组和中药组(200 mg/L),干预48 h.采用CCK-8检测细胞增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度;Western blot检测细胞p16、p21、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和p62蛋白表达;免疫荧光检测自噬流变化.结果 与空白对照组比较,衰老模型组细胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表达降低,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量和p16、p21、p62蛋白表达增加,并存在自噬流阻滞;与衰老模型组比较,中药组细胞增殖能力增强,LC3B-Ⅱ表达升高,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量减少,p16、p21和p62表达降低,自噬流畅通.结论 人参三七川芎提取物可延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老,其机制可能与增强细胞自噬活性有关.
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人参三七川芎提取物延缓内皮细胞复制性衰老的机制研究
目的:探讨人参三七川芎提取物对内皮细胞复制性衰老(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影响.方法:体外培养的HUVEC-2C传代至第8代,造成内皮细胞复制性衰老模型.细胞分为4组,8代衰老模型组、维生素E(Vit E)组(50 mg·L~(-1))、中药高、低(50,20 mg·L~(-1))剂量组,采用衰老相关卢β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量,硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(NO)和抗超氧阴离子水平,Western-blot法检测各组细胞AngII1型和2型受体(AT_1R和AT_2R),NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达.结果:8代衰老模型组β-gal染色阳性细胞数明显增多,细胞停滞在G_0/G_1期,激光共聚焦显微镜下ROS荧光强度明显增强,培养液中抗超氧阴离子、NO含量减少,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达上调.给予高、低剂量中药处理后,可明显改善细胞的衰老状态,β-gal染色阳性细胞数减少,G_0/G_1期细胞减少,G_2/M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较8代衰老模型组增加,p47phox,AT_1R,AT_2R蛋白表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论:人参三七川芎提取物能够延缓内皮细胞复制性衰老,通过活性氧途径下调NADPH氧化酶p47phox的表达,终使ROS产生减少;同时,中药提取物还能降低衰老内皮细胞AT_1R,AT_2R的表达,改善内皮功能,这可能是益气活血中药延缓内皮细胞衰老的主要原因之一.
关键词： 人参三七川芎提取物 NAD(P)H氧化酶 细胞复制性衰老 ROS -
人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白微丝的影响
观察人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白微丝F-actin和G-actin的影响.以人主动脉平滑肌细胞(HASMC)作为研究对象,复制性衰老9代细胞作为衰老模型,实验分为青年组(5代细胞)、模型组(9代细胞)、中药低剂量组(l00mg· L-1)、中药中剂量组(200 mg·L-1)、中药高剂量组(400 mg·L-1)及白藜芦醇组(10 μmol·L-1),药物干预时间为48 h.应用β-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染细胞比率,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞技术分析细胞周期,免疫荧光染色观察细胞F-actin和G-actin形态的改变,Western blot检测F-actin蛋白的表达情况.与模型组相比,中药各给药组及白藜芦醇组可以有效的降低β-半乳糖苷酶染色蓝染细胞数量,提高细胞的增殖能力,减少G0/G1期的细胞数量,同时增加S期的细胞数量,减少F-actin蛋白的表达量及应力纤维的形成,且药物干预效果明显,具有统计学意义.复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型,细胞骨架微丝蛋白G-actin和F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显,人参二七川芎提取物对细胞G-actin和F-actin有明显干预作用,其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程.
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人参三七川芎提取物对自然衰老大鼠血管外膜重构的干预机制
目的 观察自然衰老大鼠血管外膜的重构特点,并探讨人参三七川芎提取物的干预作用.方法 将85只20月龄的自然衰老Wistar大鼠按体重水平分层后随机分为衰老组、人参三七川芎醇提物低、中、高剂量组(下称中药低、中、高剂量组)及氯沙坦对照组(Losartan组),每组1 7只,另选14只2月龄青年Wistar大鼠作为青年组.中药高、中、低剂量组分别给予不同剂量的人参三七川芎醇提物[1 493.4、746.7、373.4 mg/(kg·d)]灌胃给药,Losartan组给予氯沙坦钾混悬液[10 mg/(kg·d)]灌胃,衰老组及青年组给予同体积蒸馏水灌胃,均每日1次.干预15周后,采用HE染色法观察各组大鼠胸主动脉壁形态;采用苦味酸天狼猩红染色法观测血管壁胶原种类、分布和含量;放射免疫分析法检测血浆肾素活性(plasma renin activity,PRA)、血浆血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)浓度及外膜组织AngⅡ含量;生物化学分析法检测外膜组织羟脯氨酸水平;实时荧光定量多聚酶链式反应(real-time PCR,RT-PCR)检测外膜组织血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡreceptor 1,AT1 R)、血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱreceptor 2,AT2 R)mRNA水平;Western blot法检测外膜组织AT1R、AT2R蛋白表达水平.结果 与青年组比较,衰老组血管外膜增厚,外膜厚度/管径增高,胶原纤维堆积,Ⅰ型胶原面积增加,Ⅲ型胶原面积减少,Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原降低(P＜0.05),血浆PRA及AngⅡ降低(P ＜0.01,P＜0.05),外膜组织AngⅡ及羟脯氨酸含量增高,AT1R mRNA及蛋白表达下调,AT2 R mRNA及蛋白表达上调(P ＜0.01,P＜0.05).与衰老组比较,中药低、中、高剂量组均可改善衰老血管形态学改变;中药中、高剂量组及Losartan组外膜厚度/管径均减小,中药高剂量组及Losartan组Ⅰ型胶原面积减少,Ⅲ型胶原面积增加,Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原明显升高,血管外膜羟脯氨酸含量明显降低(P ＜0.05,P＜0.01);中药中、高剂量及Losartan组外膜组织中AngⅡ水平降低(P ＜0.01,P＜0.05);衰老组、中药各剂量组、Losartan组各组间PRA比较,差异无统计学意义(P＞0.05).与衰老组比较,各治疗组AT1R mRNA表达均增加(P＜0.01),中药中、高剂量组AT2R mRNA表达亦增加(P＜0.05);中药高剂量组及Losartan组AT1 R蛋白表达升高(P ＜0.01,P＜0.05);中药中、高剂量组AT2R蛋白表达亦升高(P＜0.05).结论 衰老大鼠血管出现外膜重构,表现为外膜增厚,胶原堆积,Ⅰ型、Ⅲ型胶原比例紊乱等,其机制可能与局部肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)激活有关;人参三七川芎提取物可能通过对外膜局部AngⅡ、AT1R等多靶位的干预,改善外膜重构,进而延缓血管衰老.
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自然衰老大鼠血管老化中细胞骨架的改变及人参三七川芎提取物的干预作用
目的 观察人参三七川芎提取物对自然衰老大鼠胸主动脉及骨架蛋白的影响.方法 50只SD雄性大鼠(8～9月龄)按体重随机分为模型组、中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组,每组各10只,模型组大鼠正常饲养至21月龄;各给药组大鼠分别从18月龄开始药物干预,中药低、中、高剂量组给药剂量分别为576、1152、2305 mg/kg,白藜芦醇组给药剂量为50 mg/kg,模型组按体重给予等体积的纯净水,每日1次,连续灌胃3个月;同时以10只SD雄性大鼠(3月龄)作为青年对照组(青年组).应用HE染色观察胸主动脉血管形态的改变,β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)特异染色法计算蓝染组织比率,免疫荧光染色观察骨架蛋白F-actin形态的改变,Western blot法检测骨架蛋白F-actin和SM22α表达情况.结果 与青年组比较,模型组血管内膜损伤且不光滑,中膜明显增生且排列紊乱,弹力板扭曲、断裂、结构不完整,外膜增生明显,SA-β-gal染色组织蓝染比率明显增加(P＜0.01),F-actin荧光强度及蛋白表达明显增多(P＜0.01),而SM22α蛋白表达明显减少(P＜0.01).药物干预后,各给药组血管壁内皮轻度受损,弹力膜结构较完整,中膜及外膜厚度明显降低(P＜0.01);SA-β-gal染色中药中剂量及白藜芦醇组蓝染比率减少(P＜0.05),而中药低、高剂量蓝染比率改变无统计学意义(P＞0.05);各给药组F-actin荧光强度明显降低(P＜0.01);蛋白表达方面,中药中、高剂量组及白藜芦醇组F-actin蛋白表达减少(P＜0.01),而中药低剂量组改变则无统计学意义(P＞0.05),各给药组SM22α蛋白表达增加(P＜0.01).结论 细胞骨架微丝蛋白F-actin形态及蛋白表达在衰老过程中改变明显,其相关蛋白SM22α蛋白表达亦改变明显,可能共同参与了血管老化的进程;人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化,且对于血管F-actin和SM22α蛋白有明显干预作用,可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程.
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人参三七川芎提取物延缓血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞衰老机制的研究
目的 探讨人参三七川芎提取物对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)衰老的影响.方法 体外培养的HUVECs加入终浓度为10-6mol/L Ang Ⅱ诱导细胞衰老,造成内皮细胞衰老模型.细胞分为Ang Ⅱ衰老模型组、空白对照组、人参三七川芎高剂量组、人参三七川芎低剂量组和缬沙坦组,采用SA-β-半乳糖染色法观察细胞衰老改变,流式细胞仪分析细胞周期,激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量,硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(NO)和抗超氧阴离子水平,Western-blot检测各组细胞Ang Ⅱ 1型和2型受体(AT1R和AT2R)、NAD(P)H氧化酶p47phox的蛋白表达.结果 Ang Ⅱ衰老模型组与空白对照组比较,β-gal染色阳性细胞数明显增多,细胞停滞在G0-G1期,激光共聚焦显微镜下ROS荧光强度明显增强,培养液中抗超氧阴离子、NO含量减少,p47phox蛋白表达明显上调,AT1R表达较空白对照组上调.给予高、低剂量中药处理后改善了细胞的衰老状态,β-gal染色阳性细胞数减少,G0-G2期细胞减少,G2-M期细胞增加,ROS荧光强度减弱,抗超氧阴离子、NO含量较AngⅡ衰老模型组增加,p47phox蛋白表达下调,AT1R表达较AngⅡ衰老模型组下调.结论 人参三七川芎提取物能够延缓AngⅡ诱导的HUVECs衰老,可通过AT1R下调NAD(P)H氧化酶p47phox表达,进而使ROS产生减少,可能是益气活血中药延缓内皮细胞衰老的主要原因之一.
