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shRNA下调 EZH2基因表达对人结肠癌细胞凋亡、增殖的影响
目的：探讨下调 EZH2基因表达对人结肠癌细胞凋亡、增殖的影响。方法以人结肠癌细胞HCT116为研究材料，设计合成针对EZH2基因mRNA的小干扰 RNA （ si －EZH2）， lipofectamine 2000脂质体转染 si －EZH2下调HCT116细胞株EZH2蛋白表达。蛋白免疫印迹法检测下调后EZH2蛋白表达水平，流式细胞术检测下调 EZH2后细胞凋亡水平，噻唑蓝（ MTT ）法检测HCT116细胞增殖能力变化。结果 si －EZH2可显著下调 EZH2蛋白表达（ P＜0．05）；下调EZH2蛋白表达后细胞凋亡比例增加，结肠癌细胞的增殖能力明显降低（ P＜0．05）。结论 EZH2可能参与了人结肠癌细胞增殖与凋亡过程，有望成为结肠癌药物治疗新靶点。
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小干扰RNA逆转人乳腺癌细胞MCF-7多药耐药的体外研究
目的 研究以多药耐药相关蛋白(MRP)为靶标的小干扰RNA(siRNA)抑制相应蛋白表达,对人乳腺癌细胞MCF-7药物敏感性的影响.方法 以MRP基因为靶标的siRNA转入MCF-7细胞,检测对MRP mRNA和蛋白表达水平的影响及其对抗肿瘤药物IC_(50)的影响.结果 经siRNA干扰后,MRP基因的mR-NA和蛋白的表达均有明显降低,肿瘤细胞对相关化疗药物的敏感性明显增加.结论 以MRP基因为靶标的siRNA一定程度上逆转了肿瘤细胞的多药耐药性.
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RNA干扰技术及其抗乙型肝炎病毒的相关研究
目前寻找新的更有效的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的方法成为广大学者关注的焦点,RNA干扰技术的出现为治疗慢性HBV感染开辟了新途径.本文就RNA干扰技术及其在抗HBV感染中的研究进展作一综述.
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siRNA作为基因治疗药物的研究难题
RNA干扰(RNAi)现象的发现与研究,为基因治疗带来新的契机,虽然小干扰RNA(siRNA)较单链反义寡核苷酸显示了更好的稳定性与基因沉默效果,但却同样面临基因治疗药物存在的共同问题,如体内的靶向性与有效性、完善的定量分析方法等等.因此,siRNA作为治疗药物还有诸多困难需要克服.目前的研究主要集中在:修饰方式与递送系统研究,以提高siRNA体内的稳定性与靶向性;siRNA定量分析方法学研究,以考察其体内药动学行为并进一步阐明其体内作用机制.
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3’-端肽缀合修饰提高寡核苷酸的血清稳定性
RNA干扰被广泛用于传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域,但体内稳定性较差限制了其在临床上的应用.本文报道了在siRNA正义链的3端缀合不同长度的肽片段均能够明显提高血清稳定性,而在siRNA反义链的3'-端缀合相同的肽片段则对血清稳定性没有影响.血清中的RNase A能够选择性水解siRNA正义链3'-末端缀合的肽片段,从而得到原siRNA片段,但反义链3'-末端缀合肽缀合物则不能在血清中得到原siRNA片段.该结果进一步证明RNase A对siRNA双链的进攻具有方向性.
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可共载基因与敏化剂用以增强多西他赛抗肿瘤效果的脂质纳米载药系统的制备与评价
本研究制备了一种纳米载药系统,通过对几种化学或基因药物的同时递送,实现多种药物的协同效应或降低肿瘤对药物的耐药性,从而达到提高肿瘤治疗的目的.在本研究中,通过考察粒径分布及载药量对不同的阳性脂材进行筛选,成功制备可以同时传递阴离子小干扰RNA (siRNA)和化疗药物多西他赛的阳性纳米脂质载体(cNLC).同时,利用能与肝癌细胞表面特异性结合的新型肽SP94对cNLC的表面进行修饰,终制得具有主动靶向功能的cNLC.琼脂糖凝胶色谱结果显示制得的cNLC可以有效的装载siRNA.超滤离心法去除游离药物后,HPLC图谱显示cNLC能够高效的包载多西他赛.与市售制剂泰索帝相比,制得的SP94-cNLC显示出更强的细胞毒性,这表明SP94修饰的cNLC能更高效的递送多西他赛进入肝癌细胞.而在姜黄素和多西他赛共载的NLC中,通过姜黄素对多西他赛的敏化作用提高多西他赛在侵袭性癌细胞中的细胞毒性,这种共载系统能够改善化疗药物单独使用时疗效较差的缺点.
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肝癌靶向的阳离子脂质体共递送多西他赛和siRNA的研究
肝细胞癌是全世界常见的恶性肿瘤之一,居癌症相关死亡原因第三位.通过在纳米载体系统上修饰靶向配体可将药物主动靶向至肿瘤细胞.随着药物制剂学的发展,采用纳米给药系统共递送化疗药物与基因药物成为了治疗肿瘤的一种手段.本研究通过薄膜超声法制备了共包载多西他赛(DTX)和小干扰RNA(siRNA)的脂质体,并用SP94对其进行修饰.血清稳定性试验表明,脂质体能较好地保护siRNA免受血清中核酸酶的降解.与未修饰的阳离子脂质体相比,SP94修饰的阳离子脂质体显著增强了制剂的在肿瘤细胞内的摄取和对肿瘤细胞的抗增殖作用,表明了SP94的主动靶向作用.本课题成功构建了主动靶向肝癌的共包载DTX和siRNA的阳离子纳米粒给药系统,为肝细胞癌的治疗提供了新的研究思路.
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D-α-生育酚-聚(2-乙基-2-(噁)唑啉)琥珀酸酯修饰siRNA脂质复合物的构建及初步评价
目的 制备D-α-生育酚-聚(2-乙基-2-(噁)唑啉)琥珀酸酯[D-α-tocopheryl poly(2-ethyl-2-oxazoline)succinate,TPOS]修饰小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)脂质复合物(TPOS-L/siRNA).方法 以普通siRNA脂质复合物(CLs/siRNA)和PEG修饰CLs/siRNA (PEG-L/siRNA)为对照,对TPOS-L/siRNA的包封率、形态、稳定性、体外释放、细胞摄取等进行评价.结果 根据正负电荷的静电吸引作用通过直接混合方法等体积混合空白CLs和siRNA,得到CLs/siRNA.CLs/siRNA具有脂质双分子层结构,包封率为(86.68±1.41)％,粒径小于200 nm.TPOS或PEG-DSPE修饰后,对CLs/siRNA包封率和粒径基本无影响,而且均能赋予脂质复合物良好的稳定性;同时TPOS-L/siRNA具有较好的pH敏感性,能够响应微酸环境,细胞摄取明显增强.结论 TPOS能够构建良好的siRNA载体,并能增加该纳米载体的稳定性和pH敏感性.
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不同工艺制备的PCL-R15/siRNA纳米复合物体外生物学效应比较评价
目的 以两亲性聚己内酯-聚精氨酸聚合物(PCL-R15)为载体,采用不同工艺流程制备得到粒径电位均不同的2种纳米颗粒,并以静电结合包载siRNA得到2种纳米复合物(NR60/siRNA和NR160/siRNA),比较两者在体外细胞水平的效应差异.方法 通过对比考察2种纳米复合物的粒径、电位、siRNA包载保护能力、细胞毒性、细胞摄取机制和基因沉默效率等方面的差异.结果 2种胶束复合物虽然具有类似的siRNA保护能力和细胞毒性,但NR160/siRNA复合物表现出较高的粒径电位值,两者粒径相差约100 nm和电位相差约20 mV.并且NR160/siRNA复合物具有更高的细胞摄取效率和更为复杂的摄取途径,表现出更强的基因沉默效率.结论 不同工艺制得的2种PCL-R15/siRNA纳米复合物可在细胞水平上引起siRNA转染效率的差异.
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多药耐药1基因小干扰RNA阳离子脂质体逆转乳腺癌多药耐药的研究
目的 探讨载体表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)逆转乳腺癌细胞多药耐药的可行性,同时解决小干扰RNA在应用过程当中存在的瞬时表达及体内递送问题.方法 以之前研究中筛选出来的能有效抑制MDR1基因表达的小干扰RNA序列为基础,构建其表达质粒,利用新型纳米隐形阳离子脂质体装载MDR1基因小干扰RNA的表达质粒,并对该阳离子脂质体进行体内外药效学研究.结果 装载小干扰RNA表达质粒的阳离子脂质体在体内外均能有效的抑制MDR1基因的表达.结论 小干扰RNA阳离子脂质体很大程度上逆转了乳腺癌的多药耐药性.纳米阳离子脂质体是小干扰RNA的理想递送载体,能够保护小干扰RNA免于降解并将小干扰RNA转运到肿瘤区发挥作用.
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阳离子脂质体-小干扰RNA复合物的处方优化及其治疗前列腺癌的体外研究
目的 研究小干扰RNA(siRNA)的新型阳离子脂质体的制备,考察此脂质体-小干扰RNA复合物对LNCap细胞中靶mRNA的沉默效应.方法 采用逆向蒸发法制备新型阳离子脂质体,并加入鱼精蛋白和小牛胸腺DNA以增加其对小干扰RNA的压缩,评价其理化性质;以LNCap细胞为模型,以lipofectamine 2000作为阳性对照,用RT-PCR方法研究脂质体-小干扰RNA复合物对前列腺癌细胞中靶基因Plk-1的沉默效应.结果 制备的脂质体(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵胆固醇的佳比例为3∶1,粒径为(117±4.3) nm,Zeta电位为(47±3.6) mV;新型阳离子脂质体小干扰RNA复合物的入胞效率显著提高,荧光显微镜显示LNCap细胞内小干扰RNA含量明显升高.结论 本实验所制备的阳离子脂质体具有较高转染效率,脂质体-小干扰RNA复合物的沉默效果显著.此新型阳离子脂质体有望成为小干扰RNA等基因治疗药物的高效传递系统.
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RNA干扰在抗HIV感染中的研究进展
目的综述近年来RNA干扰在抗HⅣ感染的研究进展.方法检索国外新发表的代表性研究论文,并对试验结果进行分析、归纳.结果与结论利用RNA干扰这一自然存在的、进化保守的抗病毒感染机制,以防疗HIV等病毒感染已成为新的研究热点,并取得了有希望的基础研究成果.在未来,有望成为抗HIV等病毒感染的有效方法.
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RNA干扰抗人免疫缺陷病毒感染的作用靶点
目的 综述了近年来RNA干扰技术在抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染中的作用靶点.方法 以近几年具有代表性的文献为依据,进行分析、归纳和整理.结果 与结论目前RNA干扰技术已广泛应用于HIV复制周期中的多个环节.RNAi不但可以靶向HIV基因组,而且可以通过降低多个与HIV复制密切相关且宿主非必需性的细胞因子的表达达到抑制HIV的目的 .RNAi在抗HIV领域的广泛应用,必将成为解决病毒耐药性的问题、进而攻克艾滋病的有力武器.
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siRNA药物研究进展
RNA干扰技术(RNAi)因其具有高效、高特异性、低毒等优点在生物医药领域方面潜力巨大,为新药的研发提供了非常好的思路.通过合理设计、化学修饰及载体可在一定程度上解决小干扰RNA (siRNA)药物快速降解、细胞摄取率低和脱靶效应等问题.笔者主要从适应证、给药方式及纳米载体等几个方面对进入临床试验的siRNA药物进行综述,为从事siRNA药物研发的研究者提供参考.
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小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达
目的:探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用,建立以真核表达载体释放生成特异基因 siRNA的方法.方法:构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒,转染A549肺肿瘤细胞,观察共转染时不同剂量siRNA对 GFP的抑制效应.结果:针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达,并当比例为1∶ 1时效果佳,而空质粒载体及无关RNAi无此效应.结论:以mU6为启动子的含特异RNAi 的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段,并且为研究基因功能的一条有效途径.
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Bcl2-siRNA提高人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂敏感性的研究
目的 探讨Bcl2-siRNA 对人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 对顺铂敏感性的影响.方法 在人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA,48h 后加入不同浓度(0、3、6、9、12、15μg/ml) 新鲜配置的顺铂溶液,药物作用48h后,用CCK-8 法检测细胞生长抑制率.荧光实时定量PCR(Real time RT-PCR) 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2mRNA 的变化,Western Blot 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2 蛋白的变化.结果 在A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA 后,细胞Bcl-2 mRNA 降低92.6%(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达也明显降低,同时细胞对顺铂的敏感性增加57.8%(P<0.05).结论 Bcl2-siRNA 能降低A549/DDP 中Bcl-2 mRNA 及蛋白的表达,增加A549/DDP 对顺铂的敏感性.
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ABCE1基因通过RNase L途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡
目的：研究ABCE1基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞，分为A组(转染ABCE1-siRNA-1组)、B组(转染ABCE1-siRNA-2组)、C组(转染空质粒组)以及D组(空白对照组)。将构建好的ABCE1的siRNA(小干扰RNA)载体转染入培养的细胞中，荧光显微镜下观察转染效率，Western Blot法检测ABCE1蛋白以及RNase L蛋白的表达，RT-PCR法检测ABCE1 mRNA的表达，MTT法分析细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞，转染后A、B组的细胞活性降低，ABCE1的表达受到阻断(P＜0.01)，RNase L蛋白含量明显增加(P＜0.01)，细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡(P＜0.01)。结论 ABCE1基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡，其机制是阻断了2-5A/RNase L细胞通路。
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组织金属蛋白酶抑制剂-1低表达系膜细胞模型的建立
目的：利用3种不同组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1) siRNA转染大鼠系膜细胞，建立高效、稳定的TIMP-1低表达系膜细胞模型，为肾疾病研究奠定实验基础。方法分别设计合成3条TIMP-1特异性siRNA序列，并以标记了绿色荧光基团6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)的无义siRNA作为对照，利用脂质体转染方法转染原代大鼠系膜细胞，收集转染后48 h的细胞，利用荧光显微镜观察绿色荧光，明确其转染成功率；同时用Trizol法分离提取系膜细胞的总RNA，利用Taqman探针方法检测试验组及对照组TIMP-1的mRNA表达水平。结果荧光显微镜观察，利用脂质体转染方法，siRNA转染效率可以达到90%以上；Taqman探针荧光定量PCR结果显示，3种不同序列的siRNA均有抑制TIMP-1表达的作用(P＜0.01)，且siTIMP1-1的效果佳。结论本研究利用siRNA转染技术，成功建立了TIMP-1低表达系膜细胞模型。
关键词： 组织金属蛋白酶抑制剂-1 小干扰RNA 系膜细胞 -
特异性小干扰RNA抑制诱骗受体3在结肠癌SW480细胞表达的研究
目的 研究特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)基因在人结肠癌SW480细胞系中的抑制作用.方法 设计特异性的DcR3 siRNA序列;构建DcR3的pSUPER表达质粒并鉴定,鉴定成功后用于转染SW480细胞.以RT-PCR的方法检测细胞转染后DcR3 mRNA的表达;以Western blotting的方法检测DcR3蛋白的表达情况,并作统计学处理.结果 与对照组相比,本实验设计两段siRNA对SW480细胞中DcR3 mRNA及蛋白表达的抑制作用明显,实验细胞DcR3 mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.01).结论 针对DcR3的siRNA质粒转染真核细胞后可抑制其mRNA及蛋白表达,为进一步探讨DcR3的功能及封闭DcR3基因表达而治疗肿瘤奠定了实验基础.
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小干扰RNA对肝星状细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用
目的 观察化学合成的小干扰RNA(siRNA)转染大鼠肝星状细胞(HSC)T6后不同时间点,对基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的抑制作用,同时筛选高效的siRNA片断.方法 对大鼠TIMP-1 mRNA nt161～181、nt 190～208、nt208～226、nt 226～244 及nt 445～463化学合成的5对siRNA和1对荧光标记的非特异siRNA(与TIMP-1 mRNA 无同源性的FITC标记的21nt siRNA),在阳离子脂质体的介导下将不同浓度的非特异siRNA转染至大鼠HSC-T6后,用流式细胞仪确定佳转染浓度.提取转染50 nmol/L siRNAs后24 h,48 h和72 h细胞蛋白,用 Western blot 检测TIMP-1蛋白质表达,筛选出抑制效率高的siRNA,同时确定siRNA转染细胞后的佳作用时间.结果 50 nmol/L siRNAs对HSC T6有较高的转染效率;5对siRNA中的3对在转染后48 h有较强的抑制HSC T6 细胞TIMP-1基因表达的作用,其中抑制作用强的1对siRNA对TIMP-1表达的抑制作用与对照组相比可增强80％以上,而在转染后72 h,其抑制作用基本消失.结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达，筛选到的高效阻抑TIMP-1表达的siRNA可构建于病毒载体,以实现长期抑制TIMP-1表达的功效.
关键词： 金属蛋白酶组织抑制因子-1 小干扰RNA 肝星状细胞
