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海南百岁老人肠道菌群构成的性别差异研究
目的 初步探讨海南省不同性别百岁老人肠道菌群构成的差异.方法 随机选取2016年4~9月海南省无消化道疾病的16例百岁老人(男女各8例),采集粪便样本,提取标本中原核生物全基因组后,采用16S rDNA高通量测序方法分析菌群构成.结果 百岁老人样本操作分类单元(OTU)均值低于普通健康人群OTU均值;各组Shannon指数比较,女性组较于男性组差异有统计学意义(P=0.034);Lefse分析结果,女性组较于男性组厚壁菌门明显呈富集状态.结论 百岁老人肠道菌群构成在整体上相对于普通健康人群简单,埃希氏菌属的相对丰度占绝对优势,百岁老人人群中女性较男性肠道菌群有着更好的多样性和均匀度.
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16SrDNA检测在临床细菌检验中的应用效果
目的:分析临床细菌检验中16SrDNA检测的应用效果.方法:制备聚合酶链式反应(PCR)反应模板、扩增16SrDNA、分析及处理PCR结果,测定UP-PCR扩增敏感性,并检测引物Primer1、Primer2的特异性,检测对PCR扩增灵敏度及粪便标本16S rDNA基因.结果:本研究检测细菌均出现特异条带,但白假丝酵母菌、人白细胞DNA均未出现特异条带;0.5麦氏单位的大肠埃希菌悬液的稀释度为10-7～ 10-1,PCR扩增后的菌液标本均呈阳性;分别采集6例健康体检者和6例腹泻患者的粪便标本,在16S rDNA检测后均出现与预期相符的PCR产物片段.结论:16SrDNA检测在临床细菌检验中的应用效果显著,具有快速、特异性和灵敏度均强等优点,可同时检测多种细菌,对于临床诊断细菌感染而提供重要依据.
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饮水镍暴露对小鼠免疫功能和肠道菌群影响的实验研究
目的 通过观察小鼠体内镍离子含量、皮肤、细胞因子及肠道菌群的变化,评价镍对小鼠免疫功能和肠道菌群的影响.方法 雌性ICR小鼠30只,随机分为高剂量组、低剂量组和对照组.采用原子吸收分光光度法测定肾脏镍含量、耳朵厚度评价镍攻击的反应、ELISA测细胞因子、16 SrDNA测序法评价肠道菌群.结果 与对照组相比,高剂量组肾脏中镍含量明显升高,分别为(0.33±0.11)和(2.61±1.29),差异有统计学意义(P=0.016).趋化因子CXCL1与耳朵厚度在各组之间差异无统计学意义(P=0.286、0.117).和对照组相比,部分肠道菌群Lachnospiraceae_NK4A136_group毛螺菌科(P=0.002)、Lachnospiraceae_UCG-001毛螺菌科(P=0.042)、Bacteroides拟杆菌科(P=0.016),以及Intestinimonas属(P=0.018)在高剂量组增加,差异有统计学意义.结论 经饮水镍暴露小鼠,会导致镍在体内沉积.镍暴露可以导致肠道菌群发生改变.实验结果未显示镍暴露可以引发先天性免疫相关细胞因子变化以及镍特异性细胞免疫应答.
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腹泻标本中肺炎克雷伯菌的分离鉴定和16S rDNA系统进化分析
目的 探讨腹泻标本中肺炎克雷伯菌属亚种的分类和鉴定.方法 腹泻标本使用麦康凯和SS培养基划线培养,挑取可疑菌落分纯后使用细菌生化鉴定仪鉴定到亚种;提取菌株的全基因组DNA,以克雷伯菌16S rDNA引物PCR扩增菌株的1500 bp 16S rDNA序列,扩增产物进行测序,测序结果 经截取后,使用Blastn程序在GenBank库中搜索16S rDNA序列的相似性匹配;用PHYLIP程序建立分离菌株及GenBank库中16S rDNA序列的进化发生树并进行分析.结果 113份腹泻标本中,经生化鉴定有25株(分离率22.2%)肺炎克雷伯菌株,其中,肺炎亚种21株(分离率18.6%)、鼻炎亚种4株,未分离到鼻硬结哑种.这些标本中未分离到常见腹泻病原菌.生化鉴定的肺炎亚种菌株均对青霉素G耐药,而对多黏菌素敏感,对呋喃坦叮、头孢噻吩、卡那霉素和妥布霉素有部分耐药.菌株的16S rDNA序列在GenBank库中搜索发现,生化鉴定为鼻炎哑种的4株菌株与沙门菌等肠道致病菌株有大相似性匹配;16S rDNA序列系统进化树将生化鉴定的肺炎亚种聚为一群,但不能将肺炎克雷伯菌属的3个亚种完全区分开来.结论 16S rDNA序列进化分析在肺炎克雷伯菌的鉴定和分类中有一定意义.
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海峡两岸荒川库蠓亲缘地理学研究
以COⅠ、16S rDNA和ITS基因为标记,选用环斑库蠓Culicoides circumscriptus(N267)作为外群,对海峡两岸10个群体77个荒川库蠓标本的遗传距离、 基因分化、 系统发育和种群结构进行分析.基于COⅠ、16S rDNA基因数据集及ITS基因数据集的AMOVA分析均显示,大的遗传变异主要来自种群内的遗传变异,在线粒体数据集及核糖体数据集的比例分别为96.75％和91.44％.不同基因的分子数据显示,不同种群间的荒川库蠓遗传分化程度低、 基因交流频繁,各个地理种群没有按照地理区划形成独特的遗传结构.气流及人为因素可能是造成其远距离扩散的主要原因.
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16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究
目的 建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法. 方法 利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针.先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析. 结果 应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化.确定双重PCR佳退火温度为52 ℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280 bp和183～192 bp;杂交温度32 ℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1 min,16种分枝杆菌的杂交效果好,特异性达100%. 结论 用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌.
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抗金黄葡萄球菌的海洋细菌分离与分子鉴定
目的 为寻求新的抗金黄葡萄球菌局部和全身性感染的药物,从烟台近海海泥样品中筛选分离对金黄葡萄球菌有抑制作用的海洋细菌,并进行分子鉴定. 方法 采集海泥样品,采用稀释法和平板划线法获得纯培养,滤纸片法检测抗菌效果,16S rDNA测序和BLAST比对构建系统发育树. 结果 分离菌命名HY-1,为革兰染色阳性杆菌,产芽胞,分解淀粉,对金黄葡萄球菌具有较强的抑菌活性,而对大肠埃希菌和MRSA作用甚微；16S rDNA序列分析和同源性检索,HY-1与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌聚成一枝,同源性达100％. 结论 从形态、生理生化、16S rDNA序列同源性、系统发育学等方面分析,HY-1为蜡样芽胞杆菌,该菌对金黄葡萄球菌有抑制作用.
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维医异常黑胆质体液质高血压人群和正常黑胆质体液质健康人群肠道菌群多样性分析
目的 了解维吾尔医学异常黑胆质体液质高血压人群和正常黑胆质体液质健康人群肠道菌群结构多样性的差异. 方法 以20例异常黑胆质体液质高血压患者和20例正常黑胆质体液质者粪便中的细菌总DNA为模板,以细菌通用引物进行16SrDNA的V6～V8区域PCR扩增和DGGE分析；切取特异条带,进行克隆、测序和核酸序列比对.结果两组体液质人群检测的共有优势条带为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),检测的差异条带为肠道产丁酸细菌和疣微菌门(Verrucomicrobia),其在两组中出现的频率差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 PCRDGGE技术检测异常黑胆质体液质高血压人群与正常黑胆质体液质人群肠道菌群的多样性存在差异,其中直肠真杆菌和多形拟杆菌的存在可能会导致异常黑胆质体液质高血压的形成和发展.
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自贡地区艾伯特埃希菌的筛查及菌株特征分析
目的 了解自贡地区人群、动物源性食品、家禽及鸟类携带艾伯特埃希菌情况及菌株特征.方法 采集市售牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鸭肠及鸡肠,不同鸟类粪便及腹泻患者和密切接触人群粪便,经EC肉汤增菌后,PCR检测eae基因,阳性增菌液接种麦康凯琼脂,挑取不发酵乳糖、eae阳性菌落进一步通过16S rDNA测序及多位点序列分型分析(MLST),确定为艾伯特埃希菌,并对菌株进行eae、cdtB多态性分析及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型分析.结果 本研究共鉴定51株艾伯特埃希菌(19株来源于鸭肠及其内容物、18株来源于鸡肠及其内容物、3株来源于腹泻患者粪便、3株来源于密切接触人群粪便、1株来源于白鹭粪便、3株来源于鸡肉、2株来源于鸭肉、1株来源于猪肉、1株来源于羊肉).eae分为6种亚型,分别为sigma、rho、iota2、epsilon3,nu及N5,而51株艾伯特埃希菌均具有Ⅱ/Ⅲ/ⅤcdtB亚型,其中3株菌同时具有Ⅰ/ⅣcdtB亚型.51株分离株共分为40种PFGE带型,呈多态性分布.结论 首次在中国腹泻患者、密切接触人群、野生白鹭、家禽和动物源性食品中证实了艾伯特埃希菌的存在,对进一步深入开展艾伯特埃希菌病原学、流行病学研究具有重要实际意义.
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苍苓散对轮状病毒肠炎患儿肠道菌群的影响
目的 研究苍苓散对轮状病毒(rotavirus,RV)肠炎患儿肠道菌群的影响.方法 收集9例RV肠炎患儿在治疗前及治疗5 d后的粪便,采用16S rDNA测序法进行生物信息分析.结果 苍苓散治疗前后的肠道菌群优势物种极其相似,但所占比例不同;2者在门水平上均以厚壁菌门的丰度为高,治疗前脱硫弧菌目、脱硫弧菌科、瘤胃菌科、嗜胆菌属、隐秘杆菌属丰度较高,治疗后乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属丰度较高,其差异有统计学意义(P<0.05).用香农指数、辛普森指数所估算的微生物群落多样性,UniFrac聚类分析判断的物种组成相似性,以及PCoA、Anosim分析及物种多响应置换过程分析等,均未能发现治疗前后的肠道菌群结构存在显著差异.结论 苍苓散的治疗,影响了RV肠炎患儿肠道中某些菌群的丰度,但需要更大样本、更深入的对照研究以明确中医药治疗婴幼儿RV肠炎影响肠道菌群的具体机制.
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乙肝肝硬化与乙肝肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群结构初步探讨
目的 研究乙肝肝硬化与乙肝肝硬化合并糖尿病患者肠道菌群结构是否存在差异性.方法 收集9例乙肝肝硬化和6例乙肝肝硬化合并糖尿病患者粪便标本,提取粪便DNA,进行PCR扩增(上游引物:5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACACGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3',下游引物:5'CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGACGAGCTGACGACARCCATG-3')并对产物进行纯化,利用Roche454高通量测序平台对两组患者的粪便菌群16SrDNA的V3-V6区域进行测序及生物信息学分析.结果 乙肝肝硬化及乙肝肝硬化合并糖尿病两组间的多样性参数(OTU数、chaol指数、simpson指数、shannon指数)均无统计学差异.后者肠道中的变形菌门明显多于前者(P＜0.05),拟杆菌门与厚壁菌门的比例无明显差异;纲的水平上,γ-变形菌纲在后者明显较多(P＜0.05),其余纲水平未见差异;目的水平上,后者伯克氏菌目较前者明显增多(P＜0.05),而脱硫弧菌目明显减少(P＜0.05),其余无统计学差异;科的水平上,韦荣球菌科、产碱菌科在后者的肠道菌群中的比例明显增多(P＜0.05),而链球菌科、梭菌科在前者肠道中占优势(P＜0.05),其余的在科水平中无统计学差异;属的水平上,Parabacteroides、Roseburia、韦荣氏球菌属、萨特氏菌属在后者的肠道菌群中的比例较多(P＜0.05),而Faecalibacterium、链球菌属在前者肠道中更占优势(P＜0.05),其余未见明显差异.结论 乙肝肝硬化与乙肝肝硬化合并糖尿病患者的肠道菌群结构具有相似性但又存在各自的特异性,某些菌群的差异有可能成为治疗乙肝肝硬化合并糖尿病的新靶点.
关键词： 乙肝肝硬化 乙肝肝硬化合并糖尿病 16SrDNA 菌群结构 -
牙龈卟啉单胞菌与牙周病相关性的聚合酶链反应研究
目的利用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P. g)的16S rDNA水平,通过检测该基因水平来探讨牙龈卟啉单胞菌的水平与牙周病的相关性.方法采集慢性牙周炎患者12例共36个龈下菌斑标本,记录临床指标(探诊深度、临床附着水平、牙龈指数、菌斑指数、龈沟出血指数),PCR检测龈下菌斑标本中的P. g 16S rDNA基因,扩增产物经琼脂糖电泳、拍照后,应用计算机软件GeneTools扫描并计量其中的相对核酸含量.结果P. g16S rDNA水平与探诊深度(P＜0.001)及牙龈指数(P＜0.01)之间存在正相关关系.结论P.g16S rDNA水平与牙周状态密切相关,对于P.g16S rDNA水平的监测有望成为牙周病诊断和治疗方案制定的辅助检查手段.
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龋病患者龈上菌斑微生物多样性的研究
目的 探讨有龋和无龋成年人龈上菌斑中微生物的组成特点及多样性差异,以期为龋病的病因学研究提供依据.方法 有龋组选择2013年7月至9月于首都医科大学口腔医学院牙体牙髓科就诊的患者,男女各8例,年龄18～ 35岁,龋失补牙数(decayed tooth and decayedmissing-filled-tooth,DMFT) ≥6且龋齿数≥3;无龋组选择同年龄段DMFT=0的知情同意者,男女各8名.每组16例.分别采集两组受试者龈上菌斑样本,应用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)联合克隆测序法对细菌组成进行研究.结果 两组共检测到6个菌门、28个菌属、88个菌种.有龋组中普氏菌属、二氧化碳噬纤维菌属、放线菌属、韦荣菌属及棒状杆菌属的检出率较高,这5个菌属克隆数的总和占有龋组总克隆数的56.2％(334/594).与有龋组相比,无龋组拥有更丰富的优势菌属组合,普氏菌属、韦荣菌属、二氧化碳噬纤维菌属、棒状杆菌属、链球菌属、放线菌属、Aggregatibacter菌属和奈瑟菌属的检出率较高,8个菌属的克隆总数占无龋组总克隆数的65.2％(354/543).有龋组微生物在菌种分类水平上的各个多样性指数均显著低于无龋组,差异有统计学意义 (P＜0.05).结论 龋病的发生并非由单一菌种所致,可能为多种细菌共同作用的结果;随着龋病的发展,龈上菌斑中的微生物多样性下降.
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16S rDNA寡核苷酸芯片鉴定致病菌的初步研究
目的:建立一种基于16S rDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病菌的技术. 方法:以16S rDNA为靶标,针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片.细菌DNA经通用引物扩增标记后,与芯片杂交,对杂交图谱进行分析归纳,得到一套种和属特异的检测模式.结果:以本室保存的33株菌(包括7个属15个种)进行初步检验,结果表明,种水平上的鉴定准确率为78.79%,21.21%可鉴定到属的水平.结论:该研究建立的16S rDNA寡核苷酸芯片技术可以稳定、特异地实现细菌的高通量鉴定,为进一步检测研究奠定了基础.
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某医院船不同舱室微生物多样性初步研究
目的：应用16S rDNA测序技术分析海军某医院船不同舱室细菌群落结构及其多样性，为医院船潜在感染的监测和控制提供科学依据。方法采用拭子涂抹方法在医院船的12个舱室（ A～L位）共采集样本31份，采用IlluminaHiseq2500高通量测序平台PE250测序策略对样品16S rDNA扩增的V3～V4区域进行测序，并进行物种分类、丰度及多样性等生物信息分析。结果31份样品共产生原始测序数据为1860．64 Mbp，每份样品平均产生54．86 Mbp的clean data序列，各样品检测的Tags数量平均为60000，Unique tags序列数量均值为58364；操作分类单元（ operational taxonomic units ， OTU）数量181～2239。在医院船12个舱室中共检测到26个细菌门纲目等类，216个细菌科，414个细菌属。其中在各级水平分布的优势菌群分别为厚壁菌门（Firmicutes）、葡萄球菌科（Staphylo－coccaceae ）和葡萄球菌属（ Staphylococcus）。在属水平，葡萄球菌属在L位和J位分布多，微球菌属在B位分布多（27．15％），不动杆菌属在K位占优势（23．83％），栖水菌属则主要见于C位。12个舱室两间共有的OTU数量占检测到OTU总数的比例均＜22．3％，其中K位有着高的Chao指数（4711．55）和Shannon－Wiener指数（8．58），及高的Simpson优势度指数（0．9905）。结论医院船菌群构成复杂、多样，以革兰阳性葡萄球菌为优势菌属，并有水生环境中的菌属分布，与陆地医院常见细菌分布存在明显差异，而且各舱室细菌物种丰度及分类也存在明显不同。
关键词： 海军医学 医院船 微生物多样性 Illumina测序 16SrDNA -
16SrDNA序列分析在鉴定30个中药品种中沙门氏菌的应用
目的 建立中药品种中沙门氏菌的16SrDNA序列分析方法,评价该方法鉴定沙门氏菌的实用性和准确性.方法 用PCR扩增各个中药品种中沙门氏菌的16SrDNA片段,将扩增后的产物纯化后,使用ABI310型基因测序仪进行测序,随后使用ABI自带菌库进行序列比对,做出相似性分析,鉴定各菌种.结果 沙门菌的分型比较多,核苷酸序列相似性达到99％以上,无法准确地对沙门菌的各个分型完全鉴定,故结果依赖于个菌库的全面性,以及进一步与血清学实验结合判定.结论 16SrDNA序列分析是一种简单,快速,特异性较强的微生物鉴定方法,但对于基因序列极其相似并且分型各不相同的沙门氏菌,还需与其他方法结合进行鉴定.
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16SrDNA序列测定在细菌鉴定中的应用
目前临床微生物鉴定主要依靠表型方法,但遇到革兰染色差、生化反应不活跃、代谢反应和生长模式较为独特的菌株,则鉴定变得十分困难.随着核酸技术发展,16SrDNA序列测定被用于细菌分型鉴定,还可用于发现和描述新的细菌种类,尤其是表型鉴定难于确定的细菌.
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急性肝衰竭时小鼠上消化道及胆汁菌群的变化
目的 研究急性肝衰竭时小鼠上消化道和胆汁内菌群的变化.方法 实验分为D-氨基半乳糖建立的肝衰竭模型组(M组)和正常对照组,采集小鼠口腔、胃、十二指肠盥洗液、胆汁,高通量测序技术测定细菌16 S rDNA的V3+V4 区,得出细菌丰度及多样性信息;LEfSe (LDA effect size) 分析找出肝衰竭前后各段的差异菌.结果 门水平上,M组小鼠口腔和胃内TM7的相对丰度高于正常对照组(P<0.05).科水平上,与正常对照组相比,M组胃内巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)减少(P<0.05),胆汁内乳杆菌科(Lactobacillaceae)增多(P<0.05).结论 急性肝衰竭时小鼠上消化道及胆汁内菌群有显著改变.
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由上呼吸道感染诱发的急性点滴型银屑病皮损生态微生物研究
目的 探讨由上呼吸道感染诱发的急性点滴型银屑病皮损表面微生物群落的特点,及其与健康对照者之间的物种差异.方法 收集具有上呼吸道感染史的急性点滴型银屑病患者(银屑病组)与无其他皮肤病皮损的健康对照(健康组)各11例,应用16SrDNA测序技术进行研究.用无菌棉拭子取材,后行DNA抽提、质检,PCR,文库构建等微生物基因提取、纯化、回收过程,随后上机测序基因并行物种注释,后对数据行α、β多样性分析寻找组内微生物种差异及组间微生物群落结构的差异,采用LEfSe分析找出差异显著的物种,由秩和检验验证差异结果.结果 2组间α多样性分析差异无统计学意义,β多样性分析发现2组存在差异的趋势.经LEfSe分析(LED值为4)与秩和检验均发现不动杆菌属物种差异具有统计学意义(P＜0.05),且在银屑病组皮损起主要作用.结论 初发或复发的具有上呼吸道感染史的急性点滴型银屑病患者皮损微生物菌群正由一个稳态向另一稳态发展,不动杆菌属在该变化中可能起到关键作用,然而整体微生物菌群的变化并不显著.
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细菌16SrDNA聚合酶链反应用于败血症诊断的临床研究
目的:建立用细菌16SrDNA高度保守区引物聚合酶链反应(PCR)扩增检测败血症病原菌的方法,并与血培养比较在败血症诊断中的价值.方法:选用病原菌所共有的16SrDNA基因保守区的一对寡核苷酸序列91E和13B为引物,对101例疑为败血症的患者和25例同期我院门诊健康查体者的血标本进行PCR检测分析.结果:101例疑败血症的血标本中,PCR阳性结果50例,阳性率为495%,血培养阳性结果22例,阳性率为21.8%,经x2检验,PCB阳性率显著高于后者(P＜0.05).25例阴性对照组DNA的PCB分析均为阴性,特异性为100%;对血培养阳性的22例进行PCR分析,结果阳性21例,以血培养作为确诊标准,PCR的敏感性为95.5%,且检测不受抗生素治疗的影响.结论:在严格控制污染的条件下,细菌16SrDNA高度保守区PCR具有高度的敏感性和特异性,该技术能为败血症提供可靠的病原菌诊断依据.
