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广藿香青枯病菌Tn5转座子插入突变体的构建
该研究以从感染了青枯病的广藿香植株中分离的青枯菌菌株PRS-84为供试菌株,利用电击转化法,对青枯菌进行Tn5转座子插入突变,在含卡那霉素的培养基上筛选抗性克隆.对抗性克隆进行卡那霉素抗性基因的PCR鉴定,并利用反向PCR技术获得转化子Tn5转座子插入位点的侧翼序列并进行序列测定与分析.结果 表明,青枯菌感受态细胞经电击转化后,获得了抗性克隆.经PCR扩增,抗性克隆在预计的约700 bp处出现特异性条带.反向PCR扩增获得了转化子Tn5转座子插入位点的侧翼序列,经序列测定及同源性分析,初步推测3个突变体的Tn5转座子插入位点基因分别为typA基因、recO基因和gidA基因.该研究建立了广藿香青枯病菌Tn5转座子插入突变体系,获得了青枯菌Tn5转座子插入突变体,为构建广藿香青枯菌突变体库及发现青枯菌致病基因奠定了基础.
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T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定
目的 利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性.方法 T4溶菌酶(T4 lysozyme)基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR Ⅰ-Not Ⅰ位点内,得到分泌型重组表达载体pPIC9K-T4L.该载体首先经限制性内切酶Sal Ⅰ酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中.经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子.随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中.结果 表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响.结论 T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性.
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利用电转化和三亲杂交方法高效转化根癌农杆菌
目的探索根癌农杆菌的高效转化方法.方法考察质粒经电击转化法转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)的影响因素,并优化其转化条件;研究采用三亲杂交方法,将带有vgb基因簇的重组质粒pYG308导入A. tumefaciens LBA4404;经PCR扩增反应进行验证.结果外加电场强度和脉冲时间是决定电转化效率的关键因素,两者适当组合才可获得高转化效率;采用对数期中期的细菌和提高细菌浓度均可提高转化效率.用三亲杂交方法转化A.tumefaciens LBA4404,可得到较高的转化效率.所获抗性转化子的质粒DNA酶切图谱正确.结论 带有双元载体(含vgb基因)的根癌农杆菌构建成功.
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人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备
目的 探讨利用噬菌体PhiX174 E基因制备人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的可行性以及适当制备条件.方法 将PhiX174 E基因克隆至温控表达系统,筛选获得裂解效率较高的质粒pMBE,通过优化转化方法 将pMBE导入Ty21a,利用温控表达系统进行Ty21a菌蜕制备.菌落计数计算菌蜕裂解效率,并通过扫描电镜和透射电镜观察其形态结构.结果 裂解质粒pMBE介导大肠杆菌DH5α的裂解效率达99.99%;通过电击转化方法 获得重组Ty21a(pMBE),利用温控表达系统成功制备Ty21a菌蜕,裂解效率达96.77%.电镜观察菌蜕结构完整并呈空泡状结构,并能看到溶菌孔道.结论 PhiX174 E基因表达可实现人伤寒沙门菌Ty21a裂解形成Ty21a菌蜕,为其作为疫苗和药物递送载体的研究奠定了基础.
关键词： Ty21a菌 细菌菌蜕 电击转化 噬菌体PhiX174 E基因 -
可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库构建方法的建立及其实验参数的优化
目的 建立可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库的构建方法 并优化其实验参数.方法 体外合成可编码随机12肽的DNA片段.将该DNA片段克隆入带有EGFP标记的逆转录病毒载体pQCX-IX-EGFP,连接产物电击转化大肠杆菌,转化所得菌液即为可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库,其间通过大量的实验优化:插入片段与载体的摩尔比、连接反应的条件、连接产物的DNA浓度以及电击转化参数等关键的实验参数.结果 按照本研究所确立的方法 和佳实验参数构建的可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库的滴度为2.85×105cfu/mL,成功转化子的比例接近100%,编码随机12肽的DNA序列正确率为83%.结论 成功建立了可表达随机12肤库的逆转录病毒初级文库的构建方法 ,并确定了佳的实验参数,为后续的可表达随机12肽库的逆转录病毒表达系统的建立奠定了良好的基础.
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鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究
目的构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化.方法抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体,双酶切目的片断和植物表达载体,以T4连接酶将目的片断与载体相连接,电转化方式将重组质粒转入农杆菌.结果成功地将目的基因定向克隆到表达载体,并转入到农杆菌中.结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆,便于测序;电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒(>10kb)转入农杆菌中.
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Candida cloacae源脂肪酸醇氧化酶基因的植物表达质粒构建及农杆菌转化研究
目的构建表达Candida cloacae源脂肪酸醇氧化酶基因的植物表达质粒及对农杆菌转化.方法脂肪酸醇氧化酶基因经RT-PCR扩增后直接克隆pET-17b载体,双酶切目的片断和植物表达载体,以T4连接酶将目的片断与载体相连接,电转化方式将重组质粒转入农杆菌.结果成功地将目的基因定向克隆到表达载体,并转入到农杆菌中.结论 pET-17b载体可直接进行PCR扩增产物克隆;大分子量质粒(＞12kb) 可通过电转化方式有效导入农杆菌中.
关键词： Candida cloacae 脂肪酸醇氧化酶基因 载体构建 电击转化
