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2009～2010年北京儿童腹泻中轮状病毒新VP4基因亚型的研究
P[8]b基因亚型是国内外新近发现的A组人轮状病毒(HRV) VP4基因的一种新亚型,本研究旨在建立有效鉴别HRV P[8]a和P[8]b基因亚型及P[4]和P[6]基因型的VP4基因打点杂交分型方法,并运用此方法对2009～2010年首都儿科研究所附属儿童医院门诊及住院腹泻患儿中P[8]b基因亚型HRV的流行情况及其G/P基因组合情况进行研究.通过对GenBank序列数据库可检索到的国内外HRV各种P基因型及亚型的VP4基因序列应用相关软件进行基因分析,在不同基因型别间核苷酸变异密集而相同P基因型内核苷酸高度保守的的位置设计各型别探针,并分别以本实验室上传GenBank的北京HRV地方株P[4]和P[6]基因型及P[8]a和P[8]b亚型的VP4基因作为相应型别探针的合成引物的设计模板及探针经PCR合成的合成模板,合成地高辛素标记的DNA探针.经测序验证所建立的VP4基因杂交分型方法结果可靠.对门诊88例(55％,88/160)及住院79例(70.5％,79/112) HRV腹泻患儿的P分型结果显示P[8]a亚型仍为主要型别,前者为96.6％ (85/88),而后者为62.0％(49/79);P[8]b亚型在住院HRV感染腹泻患儿中占较高比例(27.9％,22/79),虽然其在门诊HRV感染患儿中也存在,但仅占2.3％(2/88);另外单纯P[4]基因型HRV感染仅在住院腹泻患儿中检测到1例(1.3％,1/79),而P[6]基因型在门诊及住院HRV感染腹泻患儿中均未检测到；本组标本中HRV P[8]b亚型主要与G9基因型组合.本研究表明G9P[8]b型HRV在北京腹泻儿童中有流行.
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基于VP4基因扩增和序列测定快速检测鉴别人肠道病毒的研究
目的 建立基于小核糖核酸(RNA)病毒结构蛋白HVP4基因序列测定,对人肠道病毒(HEV)进行快速检测和分型的分子生物学方法.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对2004年321例急性弛缓性麻痹(AFP)病例粪便标本进行病毒核酸提取和扩增VP4基因,然后对扩增产物测序,通过序列的分析鉴定病毒型别.结果 321份AFP病例粪便标本上清液,共检出阳性134份.获得VP4有效序列54条,其中37例RD、L20B细胞培养未检出的样本,检出HEV10例,脊髓灰质炎病毒(PV)5例,柯萨奇病毒(CV)9例,人鼻病毒(HRV)12例,埃可病毒(ECV)1例;9例细胞培养为其它HEV的样本,检出CV5例,EV2例,HRV2例;RD、L20B细胞培养结果6例与VP4测序结果相符.结论 应用VP4序列测定对HEV进行快速诊断和分型是一种快速简单的分子生物学方法,可用于HEV感染引起的爆发疫情的病原学诊断.
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口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性
目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性.方法 通过RT-PCR获得FMDV VP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒.转染BHK-21细胞后,Westem blot检测目的蛋白的表达.将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验.结果 VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确.各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力.VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0.结论 口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性.
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2007-2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析
为了解2007―2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株EV71(其中3株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本,2株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本),提取基因组RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到VP4基因片段,并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件与GenBank中的EV71 VP4基因进行序列及病毒型别分析.结果表明,所测得的8株EV71 VP4基因全长均为207 bp,编码69个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为7×103. 8株EV71病毒VP4基因的核苷酸同源性在94%～100%,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为82%～100%,与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4的核苷酸同源性比其他地区高.除了与印度报道的VP4编码的氨基酸在第7和54位不同外(印度株:7位蛋氨酸,54位苏氨酸;其余株7位苏氨酸,54位丙氨酸),这8株EV71 VP4编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%.8株EV71病毒VP4与文献报道的3株重症感染病毒株VP4 (BrCr、MS和NCKU9822)核苷酸有较大差别,而8株病毒株中从重症感染(BJ97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243)与轻症感染(BJ25、BJ47、BJ65和BJ67)分离到的毒株之间VP4基因序列未见明显改变,只有几个核苷酸存在差别.VP4核苷酸序列的进化树分析表明,这8株EV71均属于C4亚型,显示2007―2008年北京地区流行的EV71的VP4基因相当保守,分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71的VP4基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异.结果提示,近2年来北京地区所流行的EV71属C4亚型.
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VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究
目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型( EV71)非柯萨奇病毒A组16型( CoxA16)手足口病( HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16 HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型( Cox-A10)；将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。
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龙岩市2009年肠道病毒71型VP4基因序列分析
目的 分析2009年龙岩市EV71病毒VP4基因序列,进一步掌握EV71病毒感染的分子流行病学特征,为制定防制策略提供参考依据.方法 分离监测标本的EV71病毒,选择4份阳性标本进行EV71病毒VP4基因扩增和序列测定,采用相关软件对所测结果进行同源性和遗传进化树分析.结果 4份标本EV71病毒VP4基因同源性较近,大的差异性为3.3％,小差异性只有0.5％.与阜阳、安徽流行株的差异性也较小,平均1.7％和2.4％；与台湾流行株同源性差异性较大.讨论 龙岩市EV71流行株与阜阳、安徽流行株同源性相近,同属一个传播链,但引起的临床症状不同,有待进一步研究.
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猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1-756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4基因的表达,对表达的VP4蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验.结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW-8株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明JL94株与CRW-8株属同一VP4血清型,而与Gottfried株属不同血清型.JL94株VP4主要抗原编码区氨基酸大变异处位于aa81-aa207.vp4基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性.所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变.
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猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达
以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5'端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验.结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性.
关键词： 猪轮状病毒 VP4基因 VP4主要抗原位点基因 原核表达 -
东莞市2011年手足口病肠道病毒型别分析
目的 了解引起东莞市2011年手足口病疫情的肠道病毒型别.方法 采用荧光RT-PCR方法对标本中总肠道病毒、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行特异性核酸检测.对非EV71非CVA16的其它肠道病毒采用VP4基因测序进行型别鉴定.结果 2011年共检测608份手足口病病例标本,537份为阳性,其中198份为EV71阳性(占36.87％),128份为CVA16阳性(占23.84％),211份为非EV71、非CVA16的其它肠道病毒阳性(占39.29％).对其它肠道病毒进行VP4基因测序分型,共获得50个可用序列,通过BLAST在线比对确定型别,1例CVA1,43例CVA6,4例CVA10,1例CVA12,1例CVB1.结论 2011年引起手足口病的非EV71非CVA16肠道病毒构成比已超过EV71和CVA16,成为东莞引起手足口病主要病原体之一,其中CVA6构成比较大,值得进一步研究.
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鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究
目的构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化.方法抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体,双酶切目的片断和植物表达载体,以T4连接酶将目的片断与载体相连接,电转化方式将重组质粒转入农杆菌.结果成功地将目的基因定向克隆到表达载体,并转入到农杆菌中.结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆,便于测序;电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒(>10kb)转入农杆菌中.
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兰州羔羊轮状病毒株VP4基因稳定性及基因结构分析
目的 了解兰州羔羊轮状病毒(LLR)株VP4基因遗传变异特点及与人源性轮状病毒基因结构上的相关性.为疫苗的质量控制和对人体的免疫原性提供理论依据.方法 严格按疫苗生产过程将LLR疫苗株毒种LLR38代在新生儿肾原代细胞传至第49代,取LLR38、LLR43、LLR44、LLR49代进行研究.通过逆转录-聚合酶链式反应获得了LLR株传代病毒VP4全基因的cDNA片段,构建成重组质粒,经酶切筛选,对克隆的VP4基因进行序列测定.结果 LLR株VP4基因全长2362 bp,编码776个氨基酸.各代次病毒的核苷酸和氨基酸遗传稳定,核苷酸同源性在99.7%～100.0%,氨基酸同源性在99.0%～100.0%.不同P基因型来源轮状病毒在亲缘关系上没有明显的区分.氨基酸序列比对分析显示,LLR株与13株人源病毒在基因结构上密切相关.结论 LLR疫苗株VP4基因具有很好的遗传稳定性,LLR株毒种及生产的疫苗是安全有效的,能够预防轮状病毒感染.
关键词： 轮状病毒 兰州羔羊轮状病毒株 VP4基因 逆转录-聚合酶链反应 序列分析
