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姜黄素对爪蟾卵母细胞表达人低密度脂蛋白受体的影响
目的在爪蟾卵母细胞中建立人低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDL-R)表达系统,并研究姜黄素降脂作用的分子机理.方法将含人LDL-R的表达质粒p3.7 LDL导入细胞核中,用免疫荧光、配体荧光以及免疫胶体金标记透射电镜等方法检测细胞膜上LDL-R的表达情况;用不同浓度的姜黄素对爪蟾卵母细胞人LDL-R基因的表达进行干预,并用酶联免疫吸附分析法测定LDL-R的表达量.结果人LDL-R基因在爪蟾卵母细胞膜上得到表达;姜黄素具有增强其表达的作用,且有明显的量效关系.结论姜黄素降血脂和抗动脉粥样硬化的作用途径之一可以是通过促进LDL-R基因的表达,增加细胞对低密度脂蛋白胆固醇的吸收,从而降低血清胆固醇.
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Zn2+增强非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流
目的 研究Zn2+对非洲爪蟾卵母细胞ATP激活电流(IATP)的调制作用.方法 用双电极电压钳技术记录不同浓度Zn2+对IATP的影响.结果 Zn2+对IATP(尤其是D1部分)的影响有明显的浓度依赖性.3×10～mol/L(30 μmol/L)Zn2+可使IATP幅值增加(117.6±8.21)%,显著高于对照值(P＜0.01);并使IATP量-效曲线左上移,但并不改变反应的大幅值.结论 Zn2+对ATP-激活电流调制效应可能是通过改变配体和受体的亲和力而实现的变构调制.
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双极电压钳技术在促离子型受体研究中的应用
目的探讨双极电压钳技术在促离子型受体研究中的应用.方法将外源性促离子型受体的mRNA注入爪蟾卵母细胞进行表达,用双极电压钳技术记录受体激活时产生的膜电流.结果与结论在促离子型受体的研究中,实现了电生理实验与分子生物学实验的有机结合.
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钴对表达在爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流的调制
目的研究钴对P2X4受体介导的ATP-激活电流（IATP）的调制作用。方法应用双微电极电压钳技术，记录细胞外液加CoCl2对表达在爪蟾卵母细胞上的大鼠颈上神经节P2X4受体介导的IATP的调制作用。结果0.1～30μmol/L浓度范围的钴离子对P2X4受体介导的IATP呈明显的增强效应，钴浓度越高， IATP幅值越大，0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L的钴离子使IATP增加的百分比分别为：12.1±4.6，30.4±5.1，49.3±6.8，70.9±7.2，104.2±16.7，145.8±20.1（P＜0.01）；IATP的量-效曲线在钴离子的作用下向左上移位；应用1μmol/L钴离子加ATP的混合液同时灌流细胞，可导致ATP的EC50从（15.6±1.9）μmol/L降低到（8.1±0.6）μmol/L（P＜0.01）；即使是高浓度的钴，仍然对IATP表现出明显的增强作用；当ATP浓度不变，钳制电位变化（-140～60 mV）时，钴离子对P2X4受体介导的IATP的增强作用无明显变化。结论钴对P2X4受体介导的IATP的增强效应呈浓度依赖性而非电压依赖性。钴与通道蛋白胞外环的作用位点可能与锌和镉不同。
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细胞外La3+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用
本文采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外La3+对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用.细胞外La3+浓度分别为0,0.1,0.3,1,3和10mmol/L,K+浓度为90mmol/L,可见La3+对IRK1的瞬间电流(施加电压后1.5ms)具有La3+浓度依赖性、时间依赖性和电压依赖性阻断作用;阻断剂La3+对IRK1的门控特性和外向电流几乎无影响作用;细胞外加La3+后反转电位没有变化,因而IRK1对之不通透.细胞外La3+在减少IRK1电导的同时增加IRK1的归一化电导.三级指数拟合的结果表明:拟合的时间常数不随La3+浓度的增减而增减,这表明细胞外La3+对IRK1的抑制作用可能通过了表面电荷机制或La3+在通道中的阻断位点在通道表面.因为La3+浓度较低时,阻断的效力与La3+浓度较高时的差异不大,所以La3+不会通过表面电荷机制进行IRK1阻断的,因此La3+是IRK1的一种快速开通道阻断剂,其阻断位点在通道表面.
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不同亚基组成的N型钙离子通道电学特性研究
目的:建立不同辅助亚基与功能亚基重组体瞬时表达的N型钙离子通道细胞模型,观察不同亚基组成的N型钙离子通道的电学特征,揭示不同辅助亚基对功能亚基的调节作用.方法:将N型钙离子通道亚基α1B/α2δ/β1b的cDNA分别体外转录为cRNA后,注射至去除滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞中,表达48 h后使用双电极电压钳技术记录其电流.结果:向注射N型钙通道cRNA的细胞以一系列去极化刺激可诱发90%的细胞记录到内向电流.其电流可被N型钙离子通道特异性拮抗剂ω-CTX MVⅡA (1 μmol/L)完全阻断.α1B单独表达时可形成功能性N型钙离子通道,通过记录到电流后而得出电流-电压曲线(I-V曲线),可知产生电流峰值的膜电压约为20 mV(21.17±1.44)mV(n=7);α1B/β1b共表达时I-V曲线方向为超极化,电流达到峰值的电压为(12.35±0.88) mV(n=7,P＜0.01);功能亚基与α2δ亚基共表达时,I-V曲线稍向正电位方向,电流达到峰值的电压为(23.25±1.25) mV(n=7,P＜0.01);在α1B/α2δ/β1b共表达时,尽管有α2δ亚基存在时,β1b亚基仍显著地使I-V曲线向超级化方向(17.08±1.86) mV(n=7).本实验也观察了不同重组体电流的稳态失活电压,其中α1B表达电流的半数失活电压为-12.0 mV,α1B/α2δ表达电流的半数失活电压为-13.5 mV,α1B/β1b表达电流的半数失活电压为-51.4 mV,而α1B/α2δ/β1b共表达时电流半数失活电压为-54.9 mV.结论:成功地建立不同亚基组成的N型钙离子通道在爪蟾卵母细胞的功能性表达,不同的辅助亚基与功能亚基组合体现了通道不同的动力学特性,表明N型钙通道在体内可能具有功能的多样性.这些结果为今后深入研究N型钙通道奠定了基础.
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爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术及其内源性外向电流的研究
目的:建立爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术.方法:在去除滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上,建立双电极电压钳记录技术,并使用该技术观察爪蟾卵母细胞表达的内源性递质门控性和电压门控性离子通道电流.结果:灌流液中分别加入NMDA受体、γ-氨基丁酸和烟碱受体激动剂,均未能在爪蟾卵母细胞上诱发出电流.去极化刺激仅可诱发出一外向电流.此电流的幅度随细胞外液中Ca2+浓度的增加而增大.当外液中无Ca2+或无Cl-时,电流消失.此电流不被TEA所阻断,但能被MnCl2可逆性阻断.结论:成功建立了爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术.去极化刺激在爪蟾卵母细胞上诱发出的外向电流为钙依赖性Cl-电流.
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爪蟾卵母细胞表达的大鼠ASIC3电生理学特性研究
目的:研究大鼠酸感受离子通道亚基3 (acid-sensing ion channel subunit 3,ASIC3)组成的同聚体离子通道的电生理学特性.方法:将编码ASIC3亚基的cRNA注射到爪蟾卵母细胞中以表达ASIC3离子通道,使用双电极电压钳技术记录H+诱发电流,分析电流的药理学和门控动力学特征,并观察了Ca2+、Na+及K+离子对H+诱发电流的影响.结果:在注射ASIC3亚基cRNA的爪蟾卵母细胞上,降低胞外液pH值可诱导出内向电流.pH值越小则H+诱发的电流幅度越大,pH50＝5.83.H+诱发电流可被阿米洛利(氨氯吡咪)可逆性阻断,电流呈现快速和稳态失活,其失活常数分别为τ1＝(1.5±0.7) ms,τ2＝(364.5±1.3) ms.提高胞外Ca2+浓度可降低H+诱发的电流幅度,IC50＝9.16 mmol/L.当细胞外液中无Na+时,H+基本上不能诱发出内向电流;当同时去除细胞外液中Na+和K+时,H+可诱发出外向电流.结论:成功建立了特异性表达大鼠ASIC3亚基同聚体离子通道细胞模型.ASIC3除了对Na+通透外,对K+具有一定程度的通透.胞外Ca2+对ASIC3的开放具有抑制性作用.
关键词： 酸感受离子通道亚基3 爪蟾卵母细胞 电生理学 pH Ca2+ -
三七根总苷对电压依赖性钙离子和钾离子通道的作用
目的：探讨三七根总皂苷（RPNS）对电压依赖性钙离子和钾离子通道的作用。方法采用双电极电压钳检测RPNS 0.01，0.06，0.1，0.6，1及4 g·L-1对表达在爪蟾卵母细胞的Cav1.2的作用；检测RPNS 1 g·L-1对Cav2.1，Cav2.2，Cav3.1，KCNH2，KCNQ1，KCNQ1/KCNE1及大电导钙激活钾通道（BK）的作用。结果双电极电压钳实验表明，RPNS对Cav1.2的抑制作用有明显的浓度效应关系，其EC50为0.048 g·L-1。与细胞对照组相比，RPNS 1 g·L-1对Cav1.2，Cav2.2和Cav3.1有明显的抑制作用，对其峰值电流的抑制率分别为（57.1±8.6）%，（17.2±0.7）%和（50.2±7.7）%（P<0.01）；对BK通道有明显的激活作用，对其峰值电流激活率为（37.9±2.7）%（P<0.01）；对Cav2.1，KCNH2，KCNQ1和KCNQ1/KCNE1通道无明显作用。结论RPNS明显抑制Cav1.2和Cav3.1，激活BK通道，但对Cav2.1，Cav2.2，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1无明显作用。
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爪蟾卵母细胞中PPARγ-PPRE调控系统的建立和应用
目的在爪蟾卵母细胞中建立人类PPARγ-PPRE调控系统,为PPARγ配体类药物筛选提供一个可靠的实验平台.方法将调节蛋白PPAR基因构建在爪蟾卵母细胞启动子XOE下游,构成pXOE-PPARγ重组质粒;将PPRE反应元件构建在增强型绿色荧光蛋白d2EGFP报告基因的上游,得到pPPRE-d2EGFP重组质粒.将pXOE-PPARγ质粒和pPPRE-d2EGFP质粒共注射入爪蟾Ⅴ,Ⅵ期卵母细胞中,建立PPRE调控通路的表达系统,分别在含前列腺素E1(PGE1)、吡咯列酮的培养液中培养3 d,对照组共注射pXOE-PPARy质粒和pTAL-d2EGFP质粒,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果在含PGE1,吡咯列酮的卵母细胞中观测到绿色荧光蛋白;对照组未见到荧光.结论PGE1,吡咯列酮可以通过影响PPRE反应元件上调其下游基因的表达;通过核内共注射的方法在爪蟾卵母细胞中建立的PPARγ-PPRE调控系统,可作为PPAR配体类药物快速筛选和作用机制研究的细胞模型.
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山楂叶总黄酮对PPARγ-PPRE信号调控系统的影响
目的应用爪蟾卵母细胞中建立的人类PPARγ-PPRE调控信号系统,研究山楂叶总黄酮通过该系统对LPL表达的影响.方法将重组质粒pXOE-PPARγ和pPPRE-d2EGFP共注射入爪蟾V和Ⅵ期卵母细胞中,分别用含前列腺素E1(PGE1),山楂叶总黄酮等中药的培养液培养3 d,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达并做荧光扫描.将pXOE-PPARγ质粒注射入爪蟾Ⅴ和Ⅵ期卵母细胞核中,分别用PGE1,山楂叶总黄酮培养液培养3 d,用ELISA双抗体夹心法测定卵母细胞表达的脂蛋白脂酶含量.结果含PGE1阳性对照组的卵母细胞中观测到绿色荧光蛋白;山楂叶总黄酮的高、中、低3个浓度均使卵母细胞中荧光蛋白表达量增加,并有显著的量效关系.PGE1和山楂叶总黄酮所表达的LPL含量比对照组高,且2.5～10μg·mL-1的山楂叶总黄酮与LPL表达量也呈明显的量效关系.结论中药提取物山楂叶总黄酮可能含有PPARγ配体样成分,通过与PPARγ结合,诱导PPRE下游目的基因的表达.
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爪蟾卵母细胞固醇调控报告系统的建立及中药调脂作用研究
目的在爪蟾卵母细胞中建立低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控报告系统,通过中药的干预培养,从基因调控水平上阐明中药调脂作用的机制,并为药物筛选提供一个可靠的实验平台.方法将绿色荧光蛋白报告基因构建在调控低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控元件的下游,经显微注射导入爪蟾卵母细胞,在分别用含姜黄素、茶多酚等中药的培养液中培养3 d后,用荧光显微镜及荧光分析仪对绿色荧光蛋白的表达情况进行定性定量分析.结果姜黄素诱导了绿色荧光蛋白的表达.结论①姜黄素可以通过影响固醇调控元件的作用上调低密度脂蛋白受体基因的表达;②建立的固醇调控报告系统可作为降胆固醇药物筛选和作用机制研究的实验平台.
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细胞外Mn2+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用
目的和方法:采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外Mn2+ 对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用.结果:细胞外Mn2+浓度分别为0、1.25、2.5、5、10和20 mmol/L,K+浓度为90 mmol/L,可见Mn2+对IRK1的瞬间电流(施加电压后2 ms)具有Mn2+浓度依赖性和电压依赖性阻断作用;细胞外加Mn2+后反转电位没有变化,因而IRK1对之不通透.细胞外Mn 2+浓度较低时,抑制作用的效力比Mn2+浓度较高时强;细胞外K+浓度为90 mmol/ L和Ba2+浓度为30 μmol/L时,Mn2+可竞争性与Ba2+争夺结合位点,随着Mn2+浓度增加,电流失活过程逐渐减缓,电场距离分数由0.45逐渐变小至0.28,Ba 2+在通道中的结合位点也逐渐离开通道,说明多离子通道IRKl中具有多离于阻断形式 ,同时也表明Mn2+与Ba2+.都是IRKl的一种快速开通道阻断剂.结论 :细胞外Mn2+对IRK1的抑制作用通过了表面电荷机制和快速开通道阻断.
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使用爪蟾卵母细胞载体研究黄连素对Kv1.4通道C型失活的影响
目的 以非洲爪蟾卵母细胞为载体研究黄连素对去N端Kv1.4(Kv1.4ΔN)通道C型失活特性的影响.方法 将Kv1.4ΔN的mRNA注射入非洲爪蟾卵母细胞并于18～20 ℃下孵育,成功表达后使用双微电极钳制法记录电流,观察黄连素对Kv1.4ΔN电流失活、复活的影响.结果 黄连素对Kv1.4ΔN峰电流的抑制作用呈浓度依赖性和电压依赖性.黄连素可显著加速Kv1.4通道的C型失活速度,通道失活后的恢复时间延长.结论 黄连素能显著加快Kv1.4通道的C型失活速度并延长其恢复时间,其机制可能为黄连素改变了Kv1.4通道S5或S6区域的构象.
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大鼠酸感受离子通道亚基2a表达质粒的构建及生物学特性考察
目的 构建大鼠酸感受离子通道亚基2a(acid-sensing ion channel subunit 2a,ASIC2a)的表达质粒并研究其组成的同聚体离子通道的生物学特性.方法 使用分子生物学技术构建大鼠ASIC2a亚基表达质粒;通过体外转录技术,使编码ASIC2a亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞内表达并在膜表面形成同聚体离子通道;使用双电极电压钳技术研究ASIC2a的生物学特性.结果 在注射ASIC2a亚基cRNA的爪蟾卵母细胞上,降低胞外液pH值可诱导出内向电流.H+诱发的ASIC2a内向电流具有稳态失活成分可被氨氯吡咪可逆性阻断,其pH50为5.12.提高胞外Ca2+浓度可降低H+诱发的电流幅度,其IC50为11.98 mmol·L-1.当细胞外液中无Na+时,H+基本上不能诱发出内向电流;当同时去除细胞外液中Na+和K+时,H+可诱发出外向电流.结论 成功构建ASIC2a表达质粒;ASIC2a除了对Na+通透外,对K+也有一定的通透性,胞外Ca2+抑制ASIC2a孔道的开放.
关键词： 酸感受离子通道亚基2a 爪蟾卵母细胞 pH值 钙离子 -
δ-opioid Receptor Induced Inhibition of Sodium Channel Function
目的:研究δ-阿片受体表达和激活对钠通道1.2亚型的电流特性的影响.方法:用双电极电压钳技术,在δ-阿片受体和钠通道亚型1.2共表达的非洲爪蟾第V期卵母细胞上,观察δ-阿片受体表达和/或激活后,钠通道1.2亚型电流特性的变化.结果:1)钠通道1.2亚型的表达产生河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的内向电流;2)δ-阿片受体的表达减少钠通道激活电流的幅度;3)δ-阿片受体和钠通道1.2亚型共表达的卵母细胞中,δ-阿片受体激动剂可以抑制钠通道激活电流的幅度和电导,而只有钠通道1.2亚型表达的卵母细胞则无此现象;4)δ-阿片受体激动剂抑制钠电流的作用具有剂量依赖关系,并能达到饱和状态;5)δ-阿片受体激动剂对未表达外派陛蛋白的卵母细胞无影响.结论:本结果首次以直接证据证明了δ-阿片受体可以抑制钠通道的兴奋性和降低钠电流的幅度.这一发现对缺血/缺氧性神经元损伤、癫痫、疼痛等神经机能障碍的解决具有深远意义,并有助于深入揭示针刺治疗脑疾病的内在机制.
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Mg2+抑制表达在爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流
本文旨在研究Mg2+对表达在非洲爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流(ATP-activated current,IATP)的调制及机理.大鼠P2X4受体野生型及突变体型cDNA在体外转录成cRNA,通过显微注射技术将该cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞中进行表达.应用全细胞双电极电压钳技术研究Mg2+对IATP的影响.结果显示,细胞外液加MgCl2对IATP的影响如下:(1)Mg2+在0.5～10 mmol/L范围内,浓度依赖性地抑制IATP,半效抑制浓度(IC50)为(1.24±0.07) mmol/L,冲洗10 min后,IATP可恢复;(2)1 mmol/L的Mg2+使IATP量-效曲线右下移,大效应电流(Emax)降低了(42.0±2.1)％,但半数有效浓度(EC50)不变；(3)预加Mg2+ 80 s后再加ATP,Mg2+对IATP抑制效应可达大；(4)Mg2+对IATP的抑制不受膜电位的影响；(5)以100 μmol/L ATP激活的电流为对照,将P2X4受体280位的天冬氨酸突变成不带电荷的谷氨酰胺后,相同浓度的ATP诱发的IATP幅值仅为对照值的(4.12±0.15)％；将280位的天冬氨酸突变成带负电荷的谷氨酸,IATp幅值和对照值相比没有显著性差异；(6)当P2X4受体280位的天冬氨酸缺失后,100 μmol/L ATP诱发的IATP的幅值几乎为对照值的两倍,且0.5～10 mmol/L的Mg2+对相应的IATP无明显影响.以上结果提示:Mg2+抑制P2X4受体介导的IATP是非竞争性的、可逆的、具有浓度依赖性、时间依赖性、无电压依赖性;Mg2+的这种抑制效应可能是通过作用于P2X4受体280位的天冬氨酸而实现的.
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细胞外氯离子浓度对大鼠ClC-1通道去激活动力学特性的影响
为探讨ClC-1通道的门控机制, 实验应用爪蟾卵母细胞异源性表达大鼠野生型ClC-1(WT rC lC-1)通道基因, 并使用双电极电压钳法记录通道电流.通过改变细胞外氯离子浓度, 采用双指数拟合的方法分析通道去激活电流, 对其去激活门控动力学特性进行了研究.结果表明 , 降低细胞外氯离子浓度可增加快速去激活电流成分, 减少慢速去激活成分; 同时, 慢速去激活和快速去激活电流的时间常数都显著减小, 说明细胞外氯离子浓度的改变可影响通道去激活动力学参数, 从而改变通道的门控过程.
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细胞外Ba2+对内向整流钾通道的阻断作用
实验采用双微电极电压箝(TEV)法研究Ba2+对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用. 细胞外Ba2+浓度分别为0,1,3,10和100 μmol/L,K+浓度分别为10和90 mmol/L,可见快速开通道阻断剂Ba2+对IRK1的瞬间电流(施加电压后1 ms)的阻断作用依赖Ba2+、K+、时间和电压;但对IRK1的开关特性几乎无影响,IRK1对之不通透.三级指数拟合的结果表明: 细胞外Ba2+低浓度(1和3 μmol/L)时,Ba2+与K+相互竞争同一结合位点,随着Ba2+浓度的增加,时间常数不增加但拟合的权数却呈浓度依赖性增加,所以失活过程随Ba2+浓度的增加越来越快;细胞外Ba2+高浓度(10和100 μmol/L)时,时间常数随Ba2+浓度的增加而减少,拟合的权数却呈浓度依赖性减少,失活过程也越来越快,说明Ba2+作用位点由通道的表面进入了通道更深的部位. 上述结果提示,Ba2+对IRK1的阻断存在两种不同的机制.细胞外K+浓度为90 mmol/L和Ba2+浓度为30 μmol/L时,Mg2+或Mn2+可与Ba2+争夺结合位点,随着Mg2+或Mn2+浓度增加,失活过程逐渐减缓,Ba2+在通道中的结合点也逐渐离开通道,Mg2+能而Mn2+不能进入通道较深处阻断通道,说明IRK1中有多离子阻断形式.
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Zn2+对爪蟾卵母细胞表达鲫鱼脑GABA受体的调制作用
爪蟾卵母细胞注射鲫鱼(Caresses coresses)脑mRNA后表达的GABA受体中约85%为GABAA受体.约15%的成分为GABAC受体.本文利用双电极电压箝方法结合药物灌流研究了Zn2+对这两型受体的作用.我们观察到Zn2+对它们的调制都是抑制性的、可逆的.然而,与GABAA受体相比,GABAC受体对Zn2+不太敏感.其中Zn2+抑制鲫鱼脑GABAA受体的IC50=48.4±10.1 μmol/L,而它调制GABAC受体的IC50却高达255.6±21.5μmol/L.
