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猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析
猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的.为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shimen)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因置于蜂素信号肽序列下游,使其在Sf9细胞内表达重组Shimen-E2和HCLV-E2蛋白.结果显示,重组E2蛋白以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,但二者分子量存在差异.用endo H和PNGase F对纯化后的重组E2蛋白进行去糖基化处理后,二者分子量大小变成一致,证实石门强毒株和兔化弱毒株E2蛋白分子量大小的差异可能是由于糖基化程度的差异所致.对986N糖基化位点进行定点突变后发现,突变后的Shimen-E2与野生型HCLV-E2分子量大小一致,而突变后的HCLV-E2与野生型Shimen-E2分子量大小一致,表明Shimen-E2和HCLV-E2分子量大小的差异的确是由于986N糖基化位点的差异引起的.
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H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性
不同H5亚型禽流感(AIV) HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚.本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定.结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点.158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上.所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的.因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异.
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青海省2010～2012年H3亚型流感病毒HA1基因特性研究
目的 了解2010～2012年青海省H3亚型流感病毒HA1基因变异情况,评价2010～2012WHO推荐流感疫苗株对当地H3亚型流感的预防效果. 方法 随机选择2010～2012年流感病原监测中分离到的H3亚型流感毒株,提取病毒RNA,采用RT-PCR法扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,采用MEGA4.0软件对其核苷酸序列及所推导的氨基酸序列进行基因特性分析. 结果 与2010～2012年WHO推荐疫苗株A/Perth/16/2009相比,青海省2010年H3亚型分离株有5～6个位点发生氨基酸替换,其中N81D处于抗原决定簇E区;2011年分离株有7个位点发生氨基酸替换,L157S处于抗原决定簇B区;2012年分离株有9个位点发生氨基酸替换,K144N和A198S、N278K分别处于抗原决定簇A区和B区,并在第45和144位增加了2个糖基化位点. 结论 2010～2012年青海省H3亚型流感病毒HA1基因发生不同程度的变异;2010～2012年WHO疫苗株A/Perth/16/2009对2010和2011年H3亚型流感的预防有效,对2012年H3亚型流感的预防效果不够理想.
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尿调节素与慢性肾脏疾病
一、尿调节素简介尿调节素或Tamm-Horsfall蛋白是一种分子量为95 kDa,由肾小管髓袢升支(TAL)与早期远曲小管的细胞专门合成的糖蛋白,共由640个氨基酸组成,其中包括48个半胱氨酸残基[1].7/8潜在的糖基化位点都被N.连接的复杂多触角聚糖占据,占1/3分子量[2].尿调节素在内质网中产生,然后被运送到顶端细胞膜作为GPI一连接分子,后通过蛋白酶水解切割释放到尿液中.
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肠道嗜性和神经嗜性 SIV 毒株 Gp120序列变异特点的比对分析
目的：研究SIVmac239在不同中国恒河猴体内由于免疫压力出现的病毒Env区的变异进化情况。比对分析可形成AIDS相关肠病和脑病的SIV病毒其Gp120序列的差异及特点。方法四株SIVmac239感染晚期发病恒河猴PBMC中分离的病毒及两株神经嗜性SIVmac251病毒，通过有限稀释分离培养病毒单克隆，提取病毒RNA后反转录，PCR扩增病毒gp120序列进行系统进化树分析。同时分析两组不同嗜性毒株Gp120氨基酸序列及糖基化位点的变化情况。结果 SIVmac239在四只恒河猴体内发生不同的变异进化。肠道嗜性毒株与神经嗜性毒株氨基酸序列的差异集中在V1和V4区，肠道嗜性毒株在V4区与一个糖基化位点的增加，而神经嗜性毒株的糖基化位点的变化都发生在保守区C1、C2和C3。结论 SIV肠道嗜性和神经嗜性的增强分别与包膜蛋白Gp120上V4区糖基化位点的增加和C1区的糖基化位点缺失相关，两种嗜性的差异并不表现在与嗜性形成有紧密联系的V3区上。
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丙型肝炎病毒主要流行亚型包膜糖蛋白变异性分析
目的 分析不同亚型丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E1和E2的变异性.方法 从HCV基因数据库中获得不同亚型HCV包膜序列,并利用生物信息学方法进行核苷酸序列变异性、包膜糖蛋白亲水性性及糖基化位点分析.结果 与其他亚型相比,1b亚型HCV包膜糖蛋白E1和E2区核苷酸的变异性高,且E1区的变异性高于E2区;在E1区55-72位和102-112位氨基酸处1b亚型亲水性较大;1b亚型的包膜糖蛋白E1区N-糖基化位点数多,且在60位氨基酸处单独有一糖基化位点.结论 与E2区相比,E1区的高突变可能与1b型HCV致病性较强关系密切,且1b亚型E1蛋白的大量糖基化也可能在病毒的致病及免疫逃逸中有一定作用.
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丙型肝炎病毒亚型的E1、E2变异性分析
目的 了解丙型肝炎(丙肝)病毒几种亚型(1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a和6a)包膜基因的变异性.方法 应用相应的软件分析丙肝病毒包膜蛋白(E1、E2)的核苷酸和氨基酸序列,计算这些包膜基因的非同义突变与同义突变的比值(dN/dS),并预测E1和E2的糖基化位点.结果 我们发现在丙肝病毒1b亚型内,E1与E2相比变异性更大、dN/dS值更大、糖基化位点更多.结论 E1蛋白可能在HCV免疫机制中起到重要作用,尤其是在1b亚型内,E1内基因更大的变异性、更高的dN/dS值和更多的糖基化位点数足以证实这点;将在未来有关丙肝病毒药物抵抗性和免疫机制的研究中应将E1区域纳为一个重要因素.
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汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建
目的 构建汉坦病毒糖基化位点的突变体.方法 利用基因定点突变的方法构建了5个糖蛋白突变体,即将G1、G2上的天冬酰胺置换为丙氨酸,根据被替换的位置,突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A.结果 构建的5个N-联糖基化位点的突变体,经测序图谱显示原序列中的天冬酰胺(N)均被置换为丙氨酸(A).结论 成功构建了5个糖基化位点的突变体,为进一步研究N-联糖基化的缺失对细胞融合的影响奠定了基础.
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青海省2011-2012年乙型流感病毒HA1基因特性研究
目的 了解2011-2012年青海省乙型流感病毒HA1基因变异情况.方法 随机选择2011-2012年流感病原监测中分离到的乙型流感毒株,提取病毒RNA,通过RT-PCR法扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,采用DNA Star 5.0 MegAlign和MEGA4.0生物软件对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列并进行基因特性分析.结果 12株Victoria系乙流感病毒HA1区域核苷酸序列与2009-2011年WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008同源性为88.6%~95.7%,氨基酸替换数在2~5个,所有分离株均在1个相同的氨基酸位点发生了相同的替换,部分分离株在320位减少了一个糖基化位点.5株Yamagata系乙型流感病毒HA1区域核苷酸序列与2011-2012年WHO推荐疫苗株B/Wisconsin/01/2010HA1区相比较同源性为97.7%~99.3%,氨基酸替换数在2-3个,所有分离株均在2个相同的氨基酸位点发生了相同的替换(N116K,D196N),在196位增加了一个糖基化位点.结论 青海省2011-2012年乙型流感病毒HA1基因特性正在逐渐发生变异,但尚未形成抗原漂移,今后在流感监测工作中要加强流感病原学的监测,及时发现新的乙型流感病毒变异株.
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2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒基因特性的分析
目的 分析2007年深圳市Yamagata系B型流感病毒血凝素(HA)基因的特性.方法 将2007年深圳市分离到的Yamagata采B型流感毒株进行血凝素HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用SIMMONIC软件和Mega软件对其进行分析.结果 2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒根据197-199位氨基酸的差异可以划分为A、B、C3个分支.分支C在197位上有糖基化位点的增加,而分支A、B则未在该区域呈现出糖基化位点的特征性结构.此外与今年的国内代表株B/Fujianxinluo/54/06相比,除了40号位点上的氨基酸变异为共同存在外,其余大多数的氨基酸点变异是散发存在的.部分的变异位点处在HA1区的抗原表位,可能会导致病毒的抗原性改变.结论 2007年在深圳市流行的Yamagata系B型流感病毒与B/Fujianxinluo/54/06相比基因特性已发生变化,并呈现出多样性的变化趋势.
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2006～2007年深圳市Victoria系B型流感病毒HA1基因特性的分析
目的:了解2006～2007年深圳市Victoria系B型流感病毒流行情况及HA1基因特性.方法:用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离,将分离到的Victoria系B型流感毒株进行血凝素HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用SIMMONIC软件和Mega软件对其进行分析.结果:2006～2007年深圳分离培养到的Victoria系流感毒株与同时段的疫苗株B/Malaysia/2506/04、国内代表株B/Shenzhen/155/05的核苷酸同源性极高,没有发生较大的变异;2006～2007年深圳所有的Victoria系株均在134号位点上发生了Ser到Pro的替换.除此之外,还存在个别的氮基酸点变异,部分的变异位点处在HA1区的抗原表位,会导致病毒的抗原性改变.结论:本研究未发现2007年深圳流行的Victoria系B型流感毒株与2006年的流行株在HA1片段有明显的氨基酸变异.
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江西省呼吸道合胞病毒G蛋白基因特征分析
目的 了解江西省流行的呼吸道合胞病毒(RSV)的G蛋白基因特征.方法 收集2005年-2007年流感样病例标本,进行RSV分离;对病毒G蛋白进行全基因序列测定,并与国际标准株进行比较,对G蛋白潜在的O-糖基化位点进行分析.结果 从4291份标本中分离到6株RSV.各分离株与A、B型标准株的氨基酸同源性分别为85.6％～87.6％和75.9％～ 76.7％;其3端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性高.分离株在人群免疫选择压力位点111、132、226、262、274、290、297位氨基酸上发生了变异,与A2株比较,众多的潜在的O-糖基化位点发生了改变.结论 2005年-2007年江西省RSV流行株属于GA2亚型,在G基因的人群免疫选择压力位点和糖基化位点有变异.
